一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后DC细胞的应用技术

本发明专利技术提供了一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及其应用，涉及基因修饰技术领域。本发明专利技术所述方法，包括：构建pGEM‑T‑rHPV16‑E6E7质粒，使其在宿主菌中实现原核表达；T7启动子驱动的体外转录过程，获得改良的HPV16 mRNA分子；分子转染DC细胞，得到基因修饰的DC细胞。获得的所述经基因修饰的DC细胞，能够显著增强DC细胞中MHC‑I类和II类抗原表位的表达，通过MHC‑I类途径进行抗原递呈，产生CD4+及CD8+杀伤性T细胞，修复患者特异性体液免疫和细胞免疫，进而对HPV16感染组织细胞进行杀伤，全面清除长期感染的HPV16病毒。

A Gene Modification Method for Improving the Presentation Efficiency of HPV Antigen in DC Cells and the Application of Genetically Modified DC Cells

The invention provides a gene modification method for improving the antigen presentation efficiency of HPV virus in DC cells and its application, which relates to the technical field of gene modification. The method of the invention includes: constructing pGEM T rHPV16 E6E7 plasmid to realize prokaryotic expression in host bacteria; obtaining modified HPV16 gene molecule by in vitro transcription process driven by T7 promoter; transfecting DC cells by molecules to obtain genetically modified DC cells. The obtained gene-modified DC cells can significantly enhance the expression of MHC class I and II antigen epitopes in DC cells, perform antigen presentation through MHC class I pathway, produce CD4 + and CD8 + killer T cells, repair patient-specific humoral and cellular immunity, and then kill HPV16 infected tissue cells, and completely eliminate HPV16 virus long-term infection.

【技术实现步骤摘要】
一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后DC细胞的应用
本专利技术属于基因修饰
，具体涉及一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后DC细胞的应用。
技术介绍
树突状细胞(DC细胞)来源于骨髓CD34+造血干细胞，因突起的伪足像树枝，故命名为树突状细胞，根据来源不同分为淋巴系DC和髓系DC两大类，淋巴系DC的前体与NK细胞、T细胞相同，髓系DC前体细胞与单核细胞和粒细胞相同。根据成熟度不同DC功能有差异，未成熟的DC内含重要细胞器，包括内体或称MHClI类小室和溶酶体等，高表达补体、Toll样受体，为DC摄取抗原提供结构基础；当未成熟DC摄取抗原后或受到某些因子刺激则分化为成熟DC，高表达共刺激因子(CD80、CD86、CD40、CD40L等)和粘附因子(IL12p35、IL12p40、IL12p70、IFN-γ等)，获得递呈抗原(MHC-I和MHC-II)及活化T细胞的能力。2002年，Duma等在总结前人研究的基础上，经过大量基础和临床试验验证提出“肿瘤免疫编辑”假设，认为肿瘤形成在免疫应答中分为3个阶段：清除、平衡、逃逸，其中DC在免疫应答中起到关键作用。在肿瘤的发生发展中，当宿主细胞发生癌变后，未成熟的DC经趋化作用从外周血进入肿瘤微环境，在肿瘤抗原刺激下形成成熟DC，上调抗原递呈能力，高表达共刺激因子，摄取肿瘤抗原与MHC结合成MHC-抗原肽复合物作为第一活化信号激活初始T细胞使之活化分化成为T辅助细胞(Th)和细胞毒T淋巴细胞(CTL)，从而启动体液免疫应答消灭表达HLA多肽的癌变细胞；同时高表达IL-12、IL-6、TNF-a和IL-10，增强自然杀伤细胞的直接杀伤作用，作为第二活化信号增强机体对炎症或肿瘤的免疫应答。DC分泌的趋化因子可专一性趋化初始型T细胞，促进T细胞在肿瘤部位的聚集，增强T细胞激发相应的免疫应答。然而，由于肿瘤细胞遗传的不稳定性及异质性，可逃避DC识别和摄取，从而导致肿瘤细胞不断增殖甚至转移。有研究证实：肿瘤细胞一般低表达或不表达MHCI、MHCⅡ类分子和细胞黏附分子，同时释放VEGF，TGF-β阻碍DC分化成熟，不利于加工形成MHC-抗原肽复合物，从而丧失抗原呈递功能，最终出现肿瘤增殖及转移。也有研究表明：与正常供体DC相比，从肿瘤分离得到的DC明显缺乏抗原提呈功能，进一步支持了该假说。且目前的DC疫苗均可以诱发特异性细胞毒性T细胞(CTL)反应和促使感染消退，但是存在操作步骤复杂，操作时间长，且DC细胞维持抗原提呈时间短等缺点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法及基因修饰后DC细胞的应用，所述基因修饰的DC疫苗能够表达全蛋白序列，且包含所有的抗原位点；可以长期表达抗原和细胞因子或共刺激分子，增强了DC细胞抗原递呈的能力，促进T细胞的激活。同时还可以帮助DC细胞对抗肿瘤对其的抑制，延长自身寿命和促进T细胞、NK细胞的活化。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，包括以下步骤：1)将融合基因构建进pGEM-T载体质粒中，得到重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7；所述融合基因的序列如SEQIDNO.1所示；2)将所述重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7经限制性内切酶SpeI进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动T7启动子驱动的体外转录过程，获得改良的HPV16mRNA分子；3)利用所述改良的HPV16mRNA分子转染DC细胞，获得基因修饰的DC细胞。优选的，步骤1)所述融合基因中依次包括：Kozak序列、信号肽、HPV16亚型的E6、E7序列和分子转运信号。优选的，步骤2)所述体外转录的体系为20μL体系，包括：优选的，步骤3)所述转染前还包括浓缩所述改良的HPV16mRNA分子，所述浓缩的方法包括：向体外转录的反应体系中加入30μL无核酸酶双蒸水和30μL氯化锂沉淀液，-20℃放置30～60min；4℃条件下，离心去除上清，收集RNA沉淀；利用TE缓冲液溶解所述RNA沉淀，用紫外分光光度计对RNA溶液进行定量并于-70℃保存。优选的，所述氯化锂沉淀液包括以下含量的组分：7.5M的LiCl和50mM的EDTA，所述氯化锂沉淀液的pH值为8.0。优选的，步骤3)所述转染的方法为电转染。优选的，步骤3)所述DC细胞的培养方法，包括：利用感染HPV后的外周静脉血50mL，加25mL淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核细胞层的细胞，利用无血清X-VIVO-15培养基对所述细胞进行稀释，于37℃5％CO2培养箱中孵育2.5小时，获取贴壁的单个核细胞层；用PBS洗去悬浮细胞，加入含有800IU/mL粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和500IU/mL白介素-4细胞因子的X-VIVO-15培养基培养24小时，得到未成熟的树突状细胞；每3天半量换液一次，并补足粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4细胞因子；在X-VIVO-15培养基加入重组人TNF-α、IL-1b、IL-6和PGE2，诱导DC细胞成熟。优选的，所述感染HPV为感染HPV16亚型且发展为CIN2和CIN3时期。优选的，在所述X-VIVO-15培养基中，所述TNF的终浓度为10ng/mL，所述IL-1b的终浓度为10ng/mL，所述IL-6的终浓度为1000U/mL，所述PGE2的终浓度为1mg/mL。本专利技术还提供了利用上述基因修饰方法获得的基因修饰的DC细胞在制备诱导特异性免疫应答药物中的应用。本专利技术提供了一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，以修饰后的mRNA序列进行DC细胞修饰，使细胞可以持续表达抗原，并刺激DC细胞成熟，可提高DC细胞特异性提呈HPV16型病毒抗原的能力，进而增加自体杀死HPV16病毒的免疫细胞数量，并提高免疫细胞杀伤活性，增强免疫功能，达到彻底清除HPV16病毒，阻止宫颈病变发展的目的。利用本专利技术所述方法不会复制感染性病毒颗粒，但可诱发全身免疫及MHC-I、MHC-II限制性CTL反应，并且不受体内已有载体抗体的干扰，具有安全性好，有效性强的特点。附图说明图1为融合基因结构示意图；图2为融合蛋白的结构示意图及细胞因子表达水平；图3为接种本专利技术所述DC疫苗后，外周血中CD4+/CD8+T细胞数量。具体实施方式本专利技术提供了一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，包括以下步骤：1)将融合基因构建进pGEM-T载体质粒中，得重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7；所述融合基因的序列如SEQIDNO.1所示；2)将所述重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7经限制性内切酶SpeI进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动T7启动子驱动的体外转录过程，得改良的HPV16mRNA分子；3)利用所述改良的HPV16mRNA分子转染DC细胞，得基因修饰的DC细胞。在本专利技术所述提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法中，将融合基因构建进pGEM-T载体质粒中，得重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7；所述融合基因的序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，包括以下步骤：1)将融合基因构建进pGEM‑T载体质粒中，得到重组质粒pGEM‑T‑rHPV16‑E6E7；所述融合基因的序列如SEQ ID NO.1所示；2)将所述重组质粒pGEM‑T‑rHPV16‑E6E7经限制性内切酶SpeI进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动T7启动子驱动的体外转录过程，得改良的HPV16mRNA分子；3)利用所述改良的HPV16mRNA分子转染DC细胞，得基因修饰的DC细胞。

【技术特征摘要】
1.一种提高DC细胞HPV病毒抗原提呈效率的基因修饰方法，包括以下步骤：1)将融合基因构建进pGEM-T载体质粒中，得到重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7；所述融合基因的序列如SEQIDNO.1所示；2)将所述重组质粒pGEM-T-rHPV16-E6E7经限制性内切酶SpeI进行线性化，以得到的线性化质粒作为模板，启动T7启动子驱动的体外转录过程，得改良的HPV16mRNA分子；3)利用所述改良的HPV16mRNA分子转染DC细胞，得基因修饰的DC细胞。2.根据权利要求1所述基因修饰方法，其特征在于，步骤1)所述融合基因中依次包括：Kozak序列、信号肽、HPV16亚型的E6、E7序列和分子转运信号。3.根据权利要求1所述基因修饰方法，其特征在于，步骤2)所述体外转录的体系为20μL体系，包括：2×NTP/CAP10μL；4.根据权利要求1所述基因修饰方法，其特征在于，步骤3)所述转染前还包括浓缩所述改良的HPV16mRNA分子，所述浓缩的方法包括：向体外转录的反应体系中加入30μL无核酸酶双蒸水和30μL氯化锂沉淀液，-20℃放置30～60min；4℃条件下，离心去除上清，收集RNA沉淀；利用TE缓冲液溶解所述RNA沉淀，用紫外分光光度计对RNA溶液进行定量并于-70℃保存。5.根据权利要求4所述基因修饰方法，其特征在于，所述氯化锂沉淀液包括以下含量的组分：7.5M的LiCl和50mM的EDTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕贯廷，刘薇，周立敬，邢龙龙，刘改娟，张磊，蔺广义，阴建友，
申请(专利权)人：河北省健海生物芯片技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北,13