一种CART细胞的放行检测方法技术

本发明专利技术提供了一种CART细胞的放行检测，该方法包括：细胞活率检，T细胞比例检，表达CAR病毒感染效率检，CAR+细胞数量检，CD107a分泌量检，CD3/CD28磁珠残留量检，细菌真菌内毒素检测检，支原体检测，逆转录病毒可复制性(RCR)的检测，平均载体拷贝数的检测。经过一系列严格检测的CART细胞具有均一性，稳定性的特点。更适合产业化生产CART细胞。

A Method for Detecting the Release of CART Cells

The invention provides a release detection method for CART cells. The method includes: cell biopsy, T cell proportion detection, detection of infection efficiency of expressing CAR virus, CAR + cell number detection, CD107a secretion detection, CD3/CD28 magnetic bead residue detection, bacterial and fungal endotoxin detection, Mycoplasma detection, retroviral replicability (RCR) detection, and average carrier copy number detection. After a series of strict tests, CART cells have the characteristics of homogeneity and stability. It is more suitable for industrialized production of CART cells.

【技术实现步骤摘要】
一种CART细胞的放行检测方法
本专利技术涉及医药生物领域，具体涉及一种CART细胞的放行检测方法。
技术介绍
由于生物技术产品的复杂性及易变性，技术部门仅通过对终产品的质量检定难以实现对产品的全面质量控制，所以要保证产品的安全有效和质量可控，研制单位必须从原材料(包括菌、毒种或细胞库)、生产工艺、原液、半成品、成品到贮存条件等进行全程的质量控制。而如何建立一套完善的质量控制体系，对于生物制药来说是一项复杂的系统工程，需要我们在实践中不断地探索。生物制品需进行全过程的质量控制，质量标准的建立和完善是这一过程中最重要的环节。与化学药物相比，生物制品的检定项目繁多且检定方法复杂，按照我国现行的技术标准，对于重组产品来讲，常规的检定项目就有20多项。近年来，随着国家生物制品规程的补充修订及GMP的实施，国内生物技术药物的质量标准更加规范，执行也更加到位。CART细胞作为一种活的制剂，具有更多的不确定性，作为个体化细胞制剂，每个CART细胞在生产过程中T细胞的比率不一样，T细胞的活化程度不一样，表达CAR的病毒的感染效率不同，CART细胞在体外培养的增殖速率不同，每个病人CART细胞在靶向肿瘤细胞的功能效果不同(如INF-γ和CD107a的分泌量不同，细胞杀伤率不同)，所以在CART细胞的产业化生产阶段需要一整套CART细胞的放行标准，才能保证病人获得合格的CART细胞用于回输来消灭体内的肿瘤细胞。
技术实现思路
针对以上原因，本专利技术提供了一套标准的检测CART细胞放行的方法，具体内容见下表。表1CART细胞放行检测项目和方法本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术操作简单，制备的CART安全性好,均一度高。2)本专利技术的检测方法所用到的仪器都是实验室常规小型仪器，不需要大型仪器。3)本专利技术的检测方法更易于推广，为CART的产业化生产奠定基础。附图说明图1流式检测CART细胞感染效率及CD3比例检测图2流式检测CART细胞与靶细胞共培养的CD107a的分泌图3PG4细胞添加阳性病毒后的细胞病变图具体实施方式实施例本专利技术通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本专利技术决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。本专利技术详述了几种特殊检测的实时方法，常规检测可参照中国药典的方法。实施例1.细胞计数和活率检测CAR+细胞数＝细胞浓度×回输体积×细胞感染效率。CAR+细胞数应满足临床需求量，计数结果在临床需求细胞量±15％的范围内判定为满足临床需求(临床需求量＝患者体重x每千克体重需要的细胞量)，细胞活率≥70％，即达到要求。细胞活率具体检测方法如下：台盼兰染色法检测细胞活率(一)细胞计数(1)将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。(2)将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。(3)静置3分钟。(4)镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10％以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。(二)细胞活率(1)将细胞悬液以0.5ml加入试管中。(2)加入0.5ml0.4％台盼兰染液，染色2-3分钟。(3)吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。(4)镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞表面CAR蛋白的表达方法如下：分别离心收集感染后72小时的CART细胞，PBS洗涤1次后弃上清，轻拍试管混匀细胞，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，再加入适量的Viability染料(invitrogen)，避光孵育15分钟。最后流式细胞仪检测CAR本实施例的结果如图1所示，CD3阳性的CART细胞大于95％，CART细胞的CAR表达率大于50％。实施例2.CD107a检测(1)准备4x105的CART细胞(终产品500μl)和2x105的靶细胞(Raji)，及200μlX-Vivo完全培养基(不含IL2，按1:1000加入GolgiStop)。(2)靶细胞和CART细胞离心去上清后，使用100μl的X-Vivo完全培养基(不含IL2，按1:1000加入GolgiStop)重悬CART细胞，及50μl的培养基重悬靶细胞，将细胞浓度调整成4x106/ml密度。(3)取一块V底96孔板，对照组加入50μl的CART细胞，并加入50μl培养基补齐至100μl；实验组加入50μl的CART细胞和50μl的靶细胞；后每个孔均加入1μl的CD107a抗体(1:100)，37℃培养箱孵育4小时。(4)共培养结束后，将细胞转移至流式管，3mlPBS进行洗涤，400g离心5分钟，吸弃上清。(5)配制CD3(1:50)、CD4(1:200)、CD8(1:200)抗体混合工作液100μl，加入流式管中进行染色20分钟，3mlPBS进行洗涤，400g离心5分钟，吸弃上清。加入150μlPBS重悬细胞，后上机流式检测。(6)使用FlowJo对数据进行分析。本实施例的结果如图2所示，CART细胞与靶细胞共培养后CD107a分泌量高达35％以上。实施例3.磁珠残留检测(1)取CART细胞悬液样本，总细胞数1×107个，转移至流式管中，离心去除培养基。(2)5mlPBS清洗细胞一次，离心去除上清。(3)将细胞沉淀使用2ml的PBS重悬，流式管转移到磁力架上，静置2分钟，移液器吸去溶液；(4)剩余液体定容至100μl，取10μl加入血球计数板。(5)通过计数得出磁珠的细胞浓度，计算出100μl中磁珠数量，再除以1×107后乘以3×106即可计算出每3×106个细胞中的细胞数。实施例4.逆转录病毒可复制性检测样品与293细胞共培养及PG-4S+L-试验Day1293细胞铺板(1)紫外线消毒30min，进入实验室，开启生物安全柜照明灯及风机。(2)从4℃冰箱中取出培养基，恢复到室温。(3)取出预先培养好的消化处理后的293细胞，取样计数，离心后用培养基重悬调整细胞浓度为5×105/ml。(4)取TC-treated(corning)的6孔板，将调整浓度为5×105/ml的293细胞接种于6孔板中，每孔中添加1ml的细胞悬液。阴性对照组、实验组和阳性对照组分别接种6孔板。(5)6孔板中每孔补加1ml培养基。置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。样品与293细胞共培养(1)实验分组：阴性组：293细胞本身，与实验组平行操作；实验组：待测样品；阳性组：野生型GALV病毒液。(2)首先弃掉阴性对照组293培养上清，加入1mlD10完全培养基及8ug/ml的polybrene；其次弃掉实验组293细胞培养上清，加入待测实验组样品1ml及8ug/ml的polybrene；最后弃掉阳性组293细胞培养上清，加入阳性组病毒上清1ml(GALV病毒原液稀释10倍)及8ug/ml的polybrene；置于37℃，5％CO2培养箱中培养2h。阳性组使用单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活细胞制剂，其特征在于，表达嵌合抗原受体的T细胞制剂即CART细胞制剂。

【技术特征摘要】
1.一种活细胞制剂，其特征在于，表达嵌合抗原受体的T细胞制剂即CART细胞制剂。2.根据权利要求1所述的CART细胞制剂要经过严格的放行检。3.根据权利要求2所述的CART细胞制剂的放行检，其特征在于，包括细胞活率检，T细胞比例检，表达CAR病毒感染效率检，CAR+细胞数量检，CD107a分泌量检，CD3/CD28磁珠残留量检，细菌真菌内毒素检测，支原体检测，逆转录病毒可复制性(RCR)检，平均载体拷贝数检。4.根据权利要求3所述，CART细胞活率放行标准为≥70％。5.根据权利要求3所述，T细胞比例放行标准为≥90％。6.权利要求3所述，表达CAR病毒感染效...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31