一种等比例混合两种靶点CART细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了等比例混合CD19‑CART细胞和CD22‑CART细胞的制备方法和用途。具体而言，本发明专利技术所制备的CART细胞是等比例混合CD19‑41BB CART细胞和CD22‑41BB CART细胞。本发明专利技术制备的混合CART细胞对特异性肿瘤细胞都具强烈的杀伤功能。本发明专利技术制备的混合CART细胞除了具有对肿瘤细胞的强烈杀伤功能以外还具有存活期长的特点。本发明专利技术所制备的混合CART细胞可以用于CD19和CD22两个靶点所介导的恶性肿瘤的免疫治疗包括白血病和淋巴瘤。本发明专利技术制备的混合CART细胞为基础研究和临床实验奠定了坚实基础。

Preparation and Application of an Equivalent Mixed Two Target CART Cells

The invention discloses a preparation method and application of equal proportion mixed CD19 CART cells and CD22 CART cells. Specifically, the prepared CART cells are CD19 41BB CART cells and CD22 41BB CART cells in equal proportion. The mixed CART cells prepared by the invention have strong killing function to specific tumor cells. The mixed CART cells prepared by the invention not only have strong killing function to cancer cells, but also have the characteristics of long survival period. The mixed CART cells prepared by the invention can be used for immunotherapy of malignant tumors mediated by CD19 and CD22 targets, including leukemia and lymphoma. The mixed CART cells prepared by the invention lay a solid foundation for basic research and clinical experiments.

【技术实现步骤摘要】
一种等比例混合两种靶点CART细胞的制备方法及应用
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及混合CD19-41BBCART细胞和CD22-41BBCART细胞及其用途。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CART)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CART细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CART细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CART的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素(Science.1986.233(4770):p.1318-21.)。CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-celllineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。CD22广泛表达在B细胞前体的急性淋巴白血病(BCP-ALL)中，在研究的111病例数中有109例的原始细胞中都表达CD22抗原，表达率大于90％。LarsNitschke报道CD22隶属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs,sialicacid-bindingimmunoglobulin-likelectins)家族。这个家族的蛋白只在免疫系统的细胞中表达，所有自身免疫和获得性免疫系统里的细胞类型至少表达一种Siglecs家族蛋白。B细胞表达两个这个家族的成员，其中之一就是CD22，另外一个是Siglec-G。大部分Siglecs都带有酪氨酸免疫受体依赖的抑制结构(ITIMs，immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs)，对免疫进行负调节。ITIMs上的酪氨酸经过Src家族蛋白激酶磷酸化后，产生了一些含有SH2(Srchomology2)结构域分子的结合位点。SHP1(SHP，SH2-domaincontainingproteintyrosinephosphatase)和SHP2最为重要的SH2结构域含有蛋白，这些蛋白被招募到含有ITIMs的受体后，会引起细胞内物质的去磷酸化及抑制好几条信号通路。比如CD22就是通过将SHP-1招募至自身的ITIMs从而抑制正常B细胞的BCR(B细胞受体，B-cellreceptor)引起的钙离子信号通路。CD22结合带有α2-6偶联唾液酸的配体。这种结合直接的调节着CD22和BCR的结合从而调控CD22的抑制功能，可以调控B细胞的迁移及BCR信号的阈值。Nitscheke报道CD22长度是140kDa，拥有七个免疫球蛋白样结构域，特异性的表达于B细胞系，从前B细胞(pre-Bcell)时期开始表达。CD22存在于B细胞的各个时期，包括激活的B细胞和记忆B细胞；不过在终端分化的浆细胞中缺失表达。CD22在B细胞发展中的广谱表达，使其成为一个极具吸引力的靶向B细胞的分子。嵌合抗原受体两种不同共刺激分子的二代CAR在临床上广泛应用，它们之间的功能差别也有了很多的研究。在体外，CD28或4-1BBCAR有着相似的抗肿瘤能力，但是在体内的临床前研究显示4-1BBCAR改造的T细胞可能有着更强的增殖能力和存活能力。特别的，在临床上的研究显示两种二代CAR改造的T细胞在体内都能够持续增殖，不过包含4-1BB共刺激分子的CAR改造的T细胞能够更久的存活。在针对急性淋巴瘤白血病的临床研究中，Davila等报道的CD19-28ZCART细胞能在体内存活1到3个月的。相似的，来自于NCI的CD19-CART细胞(CD28的共刺激分子)，报道的最长的存活时间为68天。而在另外的用CD19-41BB的CART细胞的研究中，CART细胞存活在6个月的达68％，而在此项研究中，B细胞发育不全的症状最高的患者可持续两年，显示了CD19-4-1BB的CART细胞连续持久的功能作用。本专利技术使用靶向两种靶点CD19和CD22的CART细胞进行等比例混合，共刺激因子选择41BB，此过程增加了CART细胞对B细胞恶性肿瘤的杀伤作用。因为CD19和CD22表达涵盖了B细胞发育的各个时期。同时体外实验也证实了混合的CART细胞具有较好的功能性，本专利技术也为临床实验奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供一种制备CART细胞的方法，是将包含CD19-CAR和CD22-CAR进行等比例混合，得到所述CART细胞。本专利技术的特征在于，所述等比例混合的CART细胞采用以下方法制备：先分别制备针对CD19和CD22靶点的CART细胞再进行等比例混合。。本专利技术第二方面提供CART细胞，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到所述CART细胞。本专利技术第三方面是CD3阳性T细胞制备，即从外周血中分离单核细胞，然后从单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞。本专利技术第四方面是T细胞的活化方法，CD3阳性T细胞采用CD3/CD28抗体方法进行刺激活化。本专利技术第五方面是逆转录病毒的包被方法，所用到的逆转录病毒载体采用Retronectin进行包被处理。本专利技术第六方面是CART细胞的培养基，所制备的CART细胞用LONZA的X-vivo15培养基+5％AB血清进行培养。CART细胞用含IL-2培养基进行培养。本专利技术第七方面是CART细胞的培养天数，CART细胞在体外培养的时间为7-14天。本专利技术第八方面是CART细胞应用范围，基因修饰的T细胞在制备治疗CD19和CD22介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述CD19和CD22介导的疾病包括白血病和淋巴瘤；更优选地，所述CD19和CD22介导的疾本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备CART细胞的方法，其特征在于，是将包含CD19‑CAR和CD22‑CAR进行等比例混合，得到所述CART细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备CART细胞的方法，其特征在于，是将包含CD19-CAR和CD22-CAR进行等比例混合，得到所述CART细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等比例混合的CART细胞采用以下方法制备：先分别制备针对CD19和CD22靶点的CART细胞再进行等比例混合。3.一种混合的嵌合抗原受体，其由两种独立的嵌合抗原受体组成，分别靶向不同靶点，共刺激因子都是41BB。4.权利要求3的嵌合抗原受体，其中所述的胞内免疫受体酪氨酸活化基序包含选自CD3ζ酪氨酸活化基序信号链。5.权利要求3的嵌合抗原受体，其由一个载体共同表达，或由两个相同或不同的载体分别表达。6.一种制备CART细胞的方法，其特征在于，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到所述CART细胞。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CD3阳性T细胞采用以下方式制备：从外周血中分离单核细胞，然后从单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述从外周血中分离单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31