一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛查肺癌的蛋白芯片的制备方法，通过构建吸烟者肺癌组织T7噬菌体展示cDNA文库，将文库中的cDNA片段插入到T7噬菌体载体中，使插入片段以融合蛋白形式展示在噬菌体外壳蛋白上，将外源蛋白或多肽基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达，通过生物淘洗和噬菌体展示技术制备了蛋白芯片，将病人的异常基因融合表达为异常蛋白，并借助蛋白芯片的高通量筛选和抗原抗体特异性结合的原理来确定肿瘤标志物，本发明专利技术的方法可在早期发现或筛查原发肿瘤，筛查肿瘤高危人群，鉴别肿瘤的良恶性，判断肿瘤的发展过程，观察肿瘤的治疗效果，预测肿瘤的复发和预后中发挥重要作用。

A preparation method of protein chip for lung cancer screening

The invention discloses a method for the preparation of a protein chip for screening lung cancer. By constructing a cDNA Library of T7 phage in a smoker's lung cancer tissue, the cDNA fragment in the library is inserted into the T7 phage carrier, and the inserted fragment is displayed on the phage shell protein in the form of fusion protein, and the exogenous protein or polypeptide gene is used. The protein chip was prepared by fusion and expression of phage specific protein gene on its surface. Protein chips were prepared by biological cleaning and phage display technology. The abnormal gene fusion of patients was expressed as abnormal protein. The tumor markers were determined by high throughput screening of protein chip and specific binding of antigen antibody. The method can be used in early detection or screening of primary tumor, screening high risk population, identifying the benign and malignant tumor, judging the process of tumor development, observing the therapeutic effect of the tumor, predicting the recurrence and prognosis of the tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法
本专利技术涉及一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法。
技术介绍
一直以来，吸烟被认为是诱发肺癌的首要危险因素，因此，研究人员一直在探索吸烟诱发肺癌的机理，并试图寻找可以作为吸烟人群肺癌风险预测的标志物，早在上世纪末，研究者们就对吸烟人群中的分子变化进行了研究，结果显示，在吸烟以及曾经吸烟但并未诊断出肺癌的人群中，p53基因变异以及甲基化已呈现出明显趋势，变化程度分别可达到70％和100％，Church等也在2009年首次利用血清中烟草特异性致癌物对吸烟人群的肺癌患病风险性进行了研究，结果显示，NNAL(烟草甲基亚硝胺)是所有检测指标中唯一一个与肺癌危险性相关的标志物，并且还可以明显区分腺癌与非腺癌患者，另外，对吸烟正常人与非吸烟正常人之间对比发现，24h的尿液中尼古丁和NNAL两种标志物的检测浓度在吸烟样本中显示明显的特异性，表明这两种标志物具有区分吸烟与非吸烟人群的特性。近年来，为了探索汉族人群中肺癌风险相关基因，我国科研人员通过全基因组关联研究(GWAS)，在中国汉族人群中鉴定出了与肺癌相关的4个新位点，在此研究中，研究人员对上万例样本进行检测，鉴定出了4个与肺癌相关联的风险位点，其中13q12.12和22q12.2为汉族人群中的新发风险位点，这项研究结果表明肺癌易感人群在基因水平上的差异性，为本研究在蛋白抗体水平寻找易感人群的差异提供了理论依据。自身免疫抗体作为免疫监视原理的产物，具有早期检测癌症发生与发展过程的能力，是近年癌症早期诊断标志物的研究方向，1998年，MitsudomiT等人对NSCLC患者血清中p53蛋白的自身免疫抗体水平进行了研究，提出p53蛋白AAb可能具有一定的诊断价值，此后对于肿瘤AAb的研究得到了更广泛的认识，Pereira-Faca等对早期肺癌细胞系中PGP9.5、膜连蛋白Ⅰ和14-3-3theta三者进行联合检测发现敏感性提高到55％，而特异性为95％，这些研究体现出了AAb联合筛查在早期肺癌检测中的优势，Rom等人在2010年报道了运用自身免疫抗体对肺癌患者、肺部有磨玻璃状阴影吸烟者、良性固体结节吸烟者、CT正常吸烟者以及正常非吸烟者血清进行了比对检测，结果表明，c-myc，CyclinA，CyclinB1，CyclinD1，CDK2和Survivin自身抗体组合能够明显区分肺癌中的吸烟人群与非吸烟人群，敏感性为81％，特异性为97％，但该组合尚不具备对吸烟人群中肺癌发生风险预测的能力，也没能用于肺癌早期筛查的功能。随着对蛋白质组学研究的不断深入，高通量蛋白芯片技术、电离质谱、qRT-PCR等技术已经发展为肿瘤标志物开发及癌症早期筛查中的重要实验手段，本课题组利用蛋白芯片与cDNA噬菌体展示相结合的技术，筛选出由5个NSCLCAAb所组成的标志物组合，其对早期NSCLC的诊断敏感性和特异性都达到91.3％，且ROC(ReceiverOperatingCharacteristics)曲线下面积达到0.99，甚至可以对潜伏期NSCLC实现83％的检测准确率，利用电离质谱技术，Yildiz等筛选出7个蛋白标志物组合模型，特异性达86％，但敏感性只有58％，最新的研究结果显示，MicroRNA作为血清检测指标在肺癌早期筛查中的效果相对较理想，Chen等利用qRT-PCR方法对10个miRNA标签进行检测，诊断敏感性为93％，特异性为90％，而Wu及其研究小组对血清中自身免疫抗体的检测结果显示，6种自身免疫抗体对早期肺癌的诊断敏感性和特异性都达到92％。综上所述，肺癌的早期发现、早期干预是有效治疗肺癌的关键，虽然近些年大量的研究已取得了一些突破性的进展，但目前还没有一种可以用于对高风险吸烟人群肺癌发病预测的检测物。人体血清中肿瘤特异性的自身免疫抗体展示出了对癌症发展过程的监测能力，是一种较为理想的肿瘤标志物，因此，筛选鉴定自身免疫抗体图谱用于对高风险发病预测的标志物，从而实现早诊、早治，降低NSCLC的发病率及死亡率。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法，用肿瘤相关蛋白检测血清中的相应抗体，此种检测方式将抗原抗体反应与蛋白芯片技术很好的结合，满足高通量筛选和多种标志物联合检测的需要。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种用于筛查肺癌的蛋白芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)建立癌组织cDNA噬菌体展示文库：选择病理资料齐全的若干份癌组织，包括一半的I期及一半的II期癌组织，提取得到总RNA，然后分离得到mRNA；将mRNA作为模板，制备得到两端分别有EcoRI和HindIII粘性末端的双链cDNA；将上述获得的双链cDNA与噬菌体混合，在连接酶的作用下，取连接产物与包装蛋白混合，得到大量具有感染性的噬菌体颗粒，扩增，形成癌组织cDNA噬菌体文库；(2)生物淘洗：通过亲和选择获得靶功能的蛋白或者多肽，进而作为标志物进行开发应用，即从上述文库中获得噬菌体展示文库；2.1G蛋白珠封闭：取两个离心管，分别加入G蛋白琼脂糖珠，离心，弃去上清，用含1％BSA的1×PBS封闭G蛋白琼脂糖珠，4℃封闭1h，然后4℃，离心，弃去上清，分别标记1、2号管；2.2血清包被：将若干份正常人血清混合均匀，然后稀释，用其包被1号管，4℃放置1h，将若干份癌病人血清混合均匀，然后稀释，用其包被2号管，4℃放置2h；1h后用1×PBS洗1号管，离心1min，去上清；2.3生物淘洗：向1号管中加入上述构建的噬菌体文库，将其混合均匀，离心，收集悬浮液，备用，2h后用1×PBS洗2号管G蛋白琼脂糖珠3次，离心，去上清，将之前步骤收集的悬浮液加入2号管中，混合均匀，4℃放置1h，然后离心去上清，再用1×PBS洗3次，离心，用含1％SDS的1×PBS对2号管进行洗脱，室温培养，然后离心，收集悬浮液，即为免疫原性噬菌体；2.4淘洗后的富集取过夜培养的免疫原性噬菌体于LB液体培养基中培养，备用；将淘洗后得到的免疫原性噬菌体加入到BLT5615中，混合均匀，然后再取其混合物上层培养基混合均匀，铺板，37℃倒置培养3-4h，长出噬菌斑；每板加入适量噬菌斑提取液，过夜，次日收集平板上的噬菌斑提取液，离心，保存上清于4℃。重复进行多轮淘洗、扩增，向最后一轮扩增后的噬菌体中加入1/10体积的80％甘油，-80℃储存，备用；2.5cDNA文库的稀释铺板；将最后一轮淘洗后的文库一系列梯度稀释，稀释多个梯度，取稀释后的多个文库分别与备用的宿主菌混合，铺板，37℃倒置培养3-4h，直到长出清晰的噬菌斑后，4℃保存；3、芯片构建与高通量筛选：3.1芯片的构建：在孔板中提前加入备用的BLT5615菌液，用灭菌牙签挑取保存的铺板中的单克隆到孔板中，置于摇床中37℃共培养3h，然后对其进行离心，分别从每孔中取适量上清于一新的孔板所对应的孔中，将原先的孔板封闭，-80℃保存，新孔板用来点样，使用自动点样仪，设置阵列为若干个亚矩阵，每个亚矩阵中为多个反应点，设置好矩阵和间距后进行取样、点样，得若干张蛋白芯片，双荧光检测系统处理蛋白芯片。进一步的，使用PolyATtractmRNAIsolationSystemⅢ分离得到mRNA。进一步的，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)建立癌组织cDNA噬菌体展示文库：选择病理资料齐全的若干份癌组织，包括一半的I期及一半的II期癌组织，提取得到总RNA，然后分离得到mRNA；将mRNA作为模板，制备得到两端分别有EcoRI和Hind III粘性末端的双链cDNA；将上述获得的双链cDNA与噬菌体混合，在连接酶的作用下，取连接产物与包装蛋白混合，得到大量具有感染性的噬菌体颗粒，扩增，形成癌组织cDNA噬菌体文库；(2)生物淘洗：通过亲和选择获得靶功能的蛋白或者多肽，进而作为标志物进行开发应用，即从上述文库中获得噬菌体展示文库；2.1G蛋白珠封闭：取两个离心管，分别加入G蛋白琼脂糖珠，用BSA封闭，标记1、2号管；2.2血清包被：将若干份正常人血清混合，稀释后，用其包被1号管，4℃放置1h，将若干份癌病人血清混合，稀释后，包被2号管，4℃放置1h；之后用PBS清洗，离心去上清；2.3生物淘洗：向1号管中加入上述构建的噬菌体文库，将其混合均匀，离心，收集悬浮液，备用，2h后用PBS洗2号管G蛋白琼脂糖珠3次，离心，去上清，将之前步骤收集的悬浮液加入2号管中，混合均匀，4℃放置，然后离心去上清，再用PBS洗脱，离心，收集悬浮液，即为免疫原性噬菌体；2.4淘洗后的富集将淘洗后得到的免疫原性噬菌体加入到BLT5615中，混合均匀，37℃倒置培养，长出噬菌斑；加入噬菌斑提取液，过夜，收集噬菌斑提取液，离心，保存上清；重复进行多轮淘洗、扩增，将最后一轮扩增后的噬菌体‑80℃储存，备用。2.5cDNA文库的稀释铺板；将最后一轮淘洗后的文库一系列梯度稀释，稀释多个梯度，取稀释后的多个文库分别与备用的宿主菌混合，铺板，37℃倒置培养，直到长出清晰的噬菌斑后，4℃保存；(3)芯片构建与高通量筛选：3.1芯片的构建：在孔板中加入BLT 5615菌液，用灭菌牙签挑取单克隆到孔板中，置于摇床培养，离心，分别从每孔中取上清于一新的孔板，用于点样，使用自动点样仪，设置矩阵和间距后进行取样、点样，得若干张蛋白芯片。...

【技术特征摘要】
1.一种用于肺癌筛查的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)建立癌组织cDNA噬菌体展示文库：选择病理资料齐全的若干份癌组织，包括一半的I期及一半的II期癌组织，提取得到总RNA，然后分离得到mRNA；将mRNA作为模板，制备得到两端分别有EcoRI和HindIII粘性末端的双链cDNA；将上述获得的双链cDNA与噬菌体混合，在连接酶的作用下，取连接产物与包装蛋白混合，得到大量具有感染性的噬菌体颗粒，扩增，形成癌组织cDNA噬菌体文库；(2)生物淘洗：通过亲和选择获得靶功能的蛋白或者多肽，进而作为标志物进行开发应用，即从上述文库中获得噬菌体展示文库；2.1G蛋白珠封闭：取两个离心管，分别加入G蛋白琼脂糖珠，用BSA封闭，标记1、2号管；2.2血清包被：将若干份正常人血清混合，稀释后，用其包被1号管，4℃放置1h，将若干份癌病人血清混合，稀释后，包被2号管，4℃放置1h；之后用PBS清洗，离心去上清；2.3生物淘洗：向1号管中加入上述构建的噬菌体文库，将其混合均匀，离心，收集悬浮液，备用，2h后用PBS洗2号管G蛋白琼脂糖珠3次，离心，去上清，将之前步骤收集的悬浮液加入2号管中，混合均匀，4℃放置，然后离心去上清，再用PBS洗脱，离心，收集悬浮液，即为免疫原性噬菌体；2.4淘洗后的富集将淘洗后得到的免疫原性噬菌体加入到BLT5615中，混合均匀，37℃倒置培养，长出噬菌斑；加入噬菌斑提取液，过夜，收集噬菌斑提取液，离心，保存上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：阴建友，钟理，刘薇，沈磊，方闪闪，
申请(专利权)人：河北省健海生物芯片技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北,13