一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒、制备及使用方法技术

本发明专利技术提供了一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒。所述试剂盒包括：RBP探针A、RBP探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；本发明专利技术还公开了所述的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量试剂盒的制备方法，该方法包括：RBP探针A的制备、RBP探针B的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本明首次将邻位连接技术方法应用在RBP的定量检测上，与现有技术方法相比，具有灵敏性高、特异性强、高通量等优点，可提高肾功能疾病的预测的准确性，具有极大的市场价值。

A kit, preparation and application method for quantitative detection of RBP content by ortho connection technology

The invention provides a kit for the quantitative detection of RBP content by ortho connection technology. The kit includes the RBP probe A, the RBP probe B, the connection buffer and the qPCR reaction liquid, and the present invention also discloses a method for the preparation of a RBP content kit for quantitative detection of the RBP content kit. The method includes the preparation of the RBP probe A, the preparation of the RBP probe B, and the use method of the kit. With the advantages of high sensitivity, high specificity and high throughput compared with the existing technical methods, this method has the advantages of high sensitivity, high specificity and high throughput compared with the existing technical methods. It can improve the accuracy of the prediction of renal function diseases and has great market value.

【技术实现步骤摘要】
一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒、制备及使用方法
本专利技术涉及一种邻位连接技术用于体外免疫诊断检测人体内RBP的含量，属于疾病诊断检测领域。
技术介绍
视黄醇结合蛋白(RetinoLBindingProtein，RBP)为血浆中由肝脏分泌的一种小分子蛋白质，由一条183个氨基酸残基组成的多肽链及少部分糖类组成，不含中性糖和氨基已糖，分子量为21,000Da。RBP主要由肝细胞的粗面内质网合成，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中，最终由尿排出。它也是血液中维生素A的转运蛋白，在维生素A的代谢中发挥重要作用。由于其半衰期较短，所以能较为敏感地反映机体的疾病状况。近年来，RBP检测及临床应用日益受到关注，检测血清RBP和尿液RBP水平对肝脏、肾脏疾病的早期诊断和疗效观察有重要意义，也经常作为临床营养状况评价的指标，用来特异地诊断早期营养不良。目前用于检测血、尿中RBP含量的方法较多，常用的有酶联免疫吸附试验法和免疫比浊法等。酶联免疫吸附试验法具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，而现在应用于临床常采用免疫比浊法，该技术已趋于成熟，操作简便，干扰因素少，但液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。而本专利技术提出的基于一种邻位连接技术检测RBP含量的免疫诊断检测方法，具有检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备常见等优势，将其应用于肾损伤疾病的监测，可以提高肾损伤疾病诊断的准确率，具有极大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种可用于定量检测RBP的检测试剂盒、其制备及使用方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种制备基于邻位连接技术定量检测RBP含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：1)抗RBP抗体偶联寡聚核苷酸的RBP探针A；2)抗RBP抗体偶联寡聚核苷酸的RBP探针B；在上述技术方案中，所述抗RBP抗体为针对RBP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。根据以上任一技术方案所述所制备的基于邻位连接技术的RBP检测试剂盒。其主要组成包括：1)RBP探针A；2)RBP探针B；3)连接缓冲液；4)qPCR反应液。以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将待测样本加入到反应孔中，再加入RBP探针A和RBP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。附图说明图1是本专利技术实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒原理示意图，其中，1-寡聚脱氧核苷酸，2-偶联剂，3-抗RBP抗体，4-待测物(RBP)，5-寡聚脱氧核苷酸，6-偶联剂，7-抗RBP抗体，8-Taqman荧光探针，9-Taq酶图2是本专利技术实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒检测线性范围图。图3是本专利技术实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒结果相关性比较。具体实施方式以下参考附图对本专利技术的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。实施例1RBP探针A的制备：1)取0.1mg抗RBP抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；2)反应结束后，加入10μL0.5mol/LTris-HCl，孵育5-10min以终止反应；3)将上述被修饰的抗体加入5’端修饰有叠氮基团的寡聚脱氧核苷酸a，4℃过夜孵育，即得到RBP探针A。实施例2RBP探针B的制备：1)取0.1mg抗RBP抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；2)反应结束后，加入10μL0.5mol/LTris-HCl，孵育5-10min以终止反应；3)将上述被修饰的抗体加入5’端修饰有叠氮基团的寡聚脱氧核苷酸b，4℃过夜孵育，即得到RBP探针B。实施例3试剂盒主要组成：1)RBP探针A；2)RBP探针B；3)连接缓冲液；4)qPCR反应液。实施例4试剂盒使用方法，包括如下步骤：1)将待测样本加入到反应孔中，再加入RBP探针A和RBP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。实施例5本专利技术试剂盒方法学评价：1.线性配制浓度为0μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、100μg/mL、300μg/mL的RBP标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入100μLRBP探针A，加入100μLRBP探针B，37℃温育10分钟。温育后，加入20μL连接缓冲液反应10min后，再加入20μLqPCR反应液进行qPCR反应，测量计算每个反应孔的Ct值。以Ct值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。2.准确度相关性比对：如图3所示，与重庆中元RBP试剂盒的相关性为：y＝0.949x+2.469，R2＝0.997。本专利技术与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。以上所述，仅为本专利技术的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：1)试剂盒主要组成：RBP探针A、RBP探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；2)使用方法：将待测样本加入到反应孔中，再加入RBP探针A和RBP探针B，孵育5‑30min后加入到连接缓冲液反应5‑30min，最后与qPCR反应液进行混合；3)检测方法：对上述2)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。

【技术特征摘要】
1.一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：1)试剂盒主要组成：RBP探针A、RBP探针B、连接缓冲液、qPCR反应液；2)使用方法：将待测样本加入到反应孔中，再加入RBP探针A和RBP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；3)检测方法：对上述2)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。2.一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)RBP探针A的制备；2)RBP探针B的制备。3.根据权利要求1所述的RBP探针A和探针B均为抗RBP抗体偶联的寡聚脱氧核苷酸。4.根据权利要求3所述的抗RBP抗体为针对RBP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。5.根据权利要求3所述的RBP探针A上的寡聚脱氧核苷酸a序列为：5’-GCATTGATCTAGTCATTCTAGTTATGTAGGGCCAACGACGACTGCAGATGAATTAATGAGGA-3’。6.根据权利要求3所述的RBP探针B上的寡聚脱氧核苷酸b序列为：5’-CGTAGCCGGCATATGGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，
申请(专利权)人：南京天纵易康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32