一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法技术

本发明专利技术提供一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法。所述试剂盒包括：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明专利技术还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的ST2诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明专利技术试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于预测急性心肌梗死(AMI)患者预后不良心血管事件发生和评估冠状动脉病变程度的能力效果的监测，提高临床医生对AMI患者或AMI高危人群的临床评价和危险分层准确率，具有极大的市场价值。

ST2 detection kit based on bimolecular fluorescence complementation technology, preparation and application method

The invention provides a ST2 detection kit based on bimolecular fluorescence complementation technology, a preparation method and a usage method thereof. The kit includes: the fluorescent protein N end fragment of anti ST2 antibody coupling and the fluorescent protein C end fragment of the anti ST2 antibody coupling; the invention also discloses a preparation method of the ST2 diagnostic kit based on the double molecular fluorescence complementary technology. The method includes the preparation of the fluorescent protein N end fragment of the anti ST2 antibody coupling and the anti ST. The preparation of the C terminal fragment of the 2 antibody coupled fluorescent protein; finally the method of using the kit is also disclosed. The kit has the advantages of simple operation, wide linear range, good specificity, free cleaning and high accuracy, and is convenient for clinical detection. It is used to predict poor prognosis of patients with acute myocardial infarction (AMI). The monitoring of the ability to assess the degree of coronary artery disease and to improve the clinical evaluation and risk stratification accuracy of the clinicians for AMI or AMI high-risk groups is of great market value.

【技术实现步骤摘要】
一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法
本专利技术涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内ST2的含量，属于疾病诊断检测领域。
技术介绍
生长刺激表达基因2蛋白(growthstimulationexpressedgene2，ST2)是IL-1受体超家族成员，最先由Tominaga在1989年发现，长期以来被认为是一个孤儿受体与炎症和免疫性疾病相关，到2005年发现了它的特异性配体IL-33，于是对ST2的研究扩展到一个新的领域。人ST2的基因位于染色体2q12，约40KD，表达于肥大细胞、巨噬细胞、激活的辅助性T细胞2(Th2)、心肌细胞和心肌成纤维细胞。ST2基因有4种转录产物，其中2个最重要的亚型是跨模型ST2(ST2L)和可溶性ST2(sST2)，是由启动子选择性剪切和3′端加工形成的。ST2L包括一个胞外结构域是由3个连续的免疫球蛋白模体组成、一个跨膜结构域和一个Toll/IL-1受体(TIR)胞内结构域；与ST2L相比，sST2缺失跨膜及胞内结构域，仅由一个含9个氨基酸的C末端序列组成，可以分泌到细胞外；而ST2V缺失第3个免疫球蛋白模体，并在C末端选择性剪接形成一个特殊的疏水区；ST2LV是选择性剪切掉了ST2L的跨膜结构域而形成。ST2基因在心肌细胞和心肌成纤维细胞遭受机械张力时均会上调表达，sST2作为IL-33的诱骗受体，与IL-33结合后阻断IL-33与ST2L的结合，减弱其下游通路激活所起的心脏保护作用，进而加重心肌重塑和心功能障碍，并与增加心衰、心肌梗死、心血管性死亡等不良心血管事件的发生。目前，检测ST2的方法主要有酶联免疫吸附试验，免疫层析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫吸附试验法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目；免疫层析法具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以进行定量的缺点。化学发光免疫分析法具有操作简单，检测速度快、高通量检测等优点，但也存在非均相反应、检测时间长、批内批间变异大的缺点。为解决上述问题，如果能利用ST2的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对血栓性疾病诊断和溶栓治疗效果监测的ST2快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、灵敏度高、免清洗、精密度高等优点；将其应用于血栓性疾病和溶栓治疗效果的监测，可以提高血栓性疾病诊断和溶栓治疗效果监测的准确率，则会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种可用于定量检测ST2的检测试剂盒、其制备及使用方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种制备基于双分子荧光互补技术ST2检测试剂盒的方法，包括如下步骤：1)抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段；2)抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段；在上述技术方案中，所述抗ST2抗体为针对ST2不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。在上述方案中，所述抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗ST2抗体的质量比为1∶1-10。在上述方案中，所述抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗ST2抗体的质量比为1∶1-10。根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒。其主要组成包括：1)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段；2)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段。以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。附图说明图1是本专利技术实施例提供的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒原理示意图；附图标记说明：1-抗ST2抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(ST2)，5-抗ST2抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。图2是本专利技术实施例提供的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒检测线性范围图。图3是本专利技术实施例提供的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒结果相关性比较。具体实施方式以下参考附图对本专利技术的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。实施例1抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例，具体实施过程为：1)将0.1mgYFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/mL。2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。3)37℃水浴反应2h。4)用脱盐柱SephadexG-25或0.05mol/LpH9.5CB透析除去过量戊二醛。5)取0.1mg抗ST2抗体，用0.05mol/LpH9.5CB配制1mg/mL抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。6)4℃，反应过夜。7)封闭：加入50μL0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。8)4℃放置2h。9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/LpH7.2PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。实施例2抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC为例，具体实施过程为：1)将0.1mgYFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/mL。2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。3)37℃水浴反应2h。4)用脱盐柱SephadexG-25或0.05mol/LpH9.5CB透析除去过量戊二醛。5)取0.1mg抗ST2抗体，用0.05mol/LpH9.5CB配制1mg/mL抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。6)4℃，反应过夜。7)封闭：加入50μL0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。8)4℃放置2h。9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/LpH7.2PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。实施例3试剂盒主要组成：1)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段；2)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段。实施例4试剂盒使用方法，包括如下步骤：1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。实施例5本专利技术试剂盒方法学评价：1.线性配制浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的ST2标准品溶液。在反应孔中分别加入20μL标准品、加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：1)试剂盒主要组成：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段；2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5‑60分钟；3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。

【技术特征摘要】
1.一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：1)试剂盒主要组成：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段；2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。2.一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；2)抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。3.根据权利要求1所述的抗ST2抗体为针对ST2不同表...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，
申请(专利权)人：南京天纵易康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32