PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法技术

本发明专利技术涉及PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法，包括以下步骤：待测PEG修饰蛋白样品处理后将PEG全部释放出来，检测PEG的质量，通过蛋白及PEG的摩尔比推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数的步骤。本发明专利技术方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型，尤其是由立体结构复杂、分子量庞大，空间位阻较大的PEG修饰的蛋白，其用其他现有方法难以准确分析PEG结合数。并且，本发明专利技术方法操作简单、重复性好、能准确分析PEG修饰蛋白PEG结合数。

Detection method of PEG binding number of PEG modified protein

The invention relates to the detection method of PEG binding number of PEG modified protein, including the following steps: after the samples of PEG modified protein are treated, all PEG is released, the quality of PEG is detected, and the steps of PEG binding number in the PEG modified protein are calculated by the mole ratio of protein and PEG. The method is suitable for different types of protein and different type of PEG modifier, especially the PEG modified protein with complex structure, large molecular weight and larger spatial steric resistance. It is difficult to accurately analyze the number of PEG binding by other existing methods. Moreover, the method is simple and repeatable, and can accurately analyze the binding number of PEG modified protein PEG.

【技术实现步骤摘要】
PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法
本专利技术涉及药物分析领域，具体涉及PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法。
技术介绍
药用蛋白和多肽普遍存在生物稳定性差、体内半衰期短和具免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行改造修饰以克服上述缺点。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。由于蛋白质上可以发生PEG修饰的位点较多，因此，反映PEG对蛋白质修饰程度的平均修饰率或PEG结合数，对该类药物构效关系研究与质量控制具有重要意义。修饰蛋白药物的PEG结合数的检测方法有：三硝基苯磺酸法(TNBS法)、荧光胺法、核磁共振、毛细管电泳(CE)、基质辅助激光扫描系统(MALDI-MS)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱等。根据方法的简单和易操作性，其中三硝基苯磺酸法(TNBS法)和荧光胺法较常用，它们的原理都是通过检测游离氨基数来反推蛋白的PEG结合数。但对于立体结构复杂、分子量庞大，空间位阻较大的PEG，TNBS法和荧光胺法很难结合到包裹在蛋白高级结构内部的游离氨基，从而不能准确分析检测PEG结合数。
技术实现思路
为克服上述技术问题，本专利技术提供可以准确检测聚乙二醇修饰蛋白中PEG结合数的方法。本专利技术的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，该方法直接检测PEG修饰蛋白中PEG的量来确定PEG结合数，包括以下步骤：待测样品处理的步骤、对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤、根据游离PEG含量推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数的步骤。所述的待测样品处理步骤是将PEG修饰蛋白药物中的PEG完全从蛋白药物分子上释放出来。释放出来的PEG可以不带任何多肽或氨基酸，也可以连接有多肽或氨基酸。优选的，所述的待测样品处理步骤是采用了蛋白酶解方法将蛋白药物水解成多肽或氨基酸，所述的蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶，并不限于实施例使用的胰蛋白酶。更优选的，所述的待测样品处理步骤是先用高温破坏PEG修饰蛋白的高级结构，然后用蛋白酶水解蛋白质成多肽或是氨基酸，释放出与蛋白结合的PEG。专利技术人还尝试了其他方法，如酸碱水解、加热等亦能达到使PEG完全从蛋白分子上释放出来的目的。本专利技术的样品处理也不限于上述方法，只要是本领域技术人员公知的能够实现将PEG完全从蛋白分子上释放出来的方法都可用于本专利技术的样品处理。优选的，所述的对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤，可以是硫氰铁铵-氯仿两相体系法，中国药典第四部通则3202聚乙二醇残留量测定法，或者是SDS-PAGE电泳法。上述的SDS-PAGE电泳法，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后染色；使用定量分析系统对染色泳道进行定量测算灰度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与灰度值的标准曲线，并将处理后的样品的染色泳道定量测算灰度值数据代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。优选的，本专利技术染色方法优选碘染方法，由于钡离子与聚乙二醇分子结合形成可溶性的氧鎓离子复合物，然后该复合物与碘离子结合形成不溶性沉淀而使条带染色。但本专利技术SDS-PAGE电泳后的染色方法并不局限于此，只要能够使PEG显色的方法都可用于本专利技术，例如在硫氰酸铁胺显色，还有碘液中加入硼酸显色法等。优选的，本专利技术采用QuantityOne软件进行染色泳道定量分析处理，但本专利技术的定量方法不局限于此，其他SDS-PAGE电泳条带定量分析方法均可用于本专利技术，如凝胶成像仪等等。优选的，本专利技术的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，具体步骤如下：供试品溶液的制备：取一定量的已知PEG修饰蛋白含量的供试品溶液，高温处理后，加入胰酶溶液，于水浴酶解，备用。PEG标准品梯度溶液的制备：精密称取与待测样品相同的PEG粉末，加水定溶解，制成含量既定的PEG标准品溶液，混匀，放置。分别取间隔一定数值的不同体积的PEG标准品溶液加入纯化水中配制成终体积相同的梯度浓度溶液，混匀，即得标准品梯度溶液。样品的制备和上样：分别取上述标准品梯度溶液和供试品溶液，进行SDS-PAGE电泳实验，并以碘染色法进行显色后，即可拍照。数据测定与计算：将照片使用QuantityOne4.4.0软件对各染色泳道进行定量测算灰度值；并根据PEG标准品梯度溶液的染色泳道的灰度值对应其相应的浓度，绘制PEG标准品的浓度与灰度值的标准曲线；将供试品溶液的对应染色泳道的灰度值代入标准曲线，计算得到供试品溶液中的所有游离PEG含量。上述的硫氰铁铵-氯仿两相体系法，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液，加入到硫氰铁铵-氯仿两相体系中；测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与吸光度值的标准曲线，并将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。上述中国药典第四部通则3202聚乙二醇残留量测定法，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液中，依次加入髙氯酸溶液、氯化钡溶液和碘溶液；混匀反应一定时间后，在波长535nm处测定吸光度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与吸光度值的标准曲线，并将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。PEG结合数计算：根据以上结果计算PEG结合数，计算公式如下：本专利技术方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型，尤其是由立体结构复杂、分子量庞大，空间位阻较大的PEG修饰的蛋白，其用其他现有方法难以准确分析PEG结合数。并且，本专利技术方法操作简单、重复性好、能准确分析PEG修饰蛋白PEG结合数。附图说明图1比较例3PEG含量-吸光度标准曲线图2实施例1方法检测不同批次PEG定点修饰的门冬酰胺酶PEG结合数，序号1-6为标准梯度溶液，7-9分别为三个不同批次的PEG-ASP双修样品溶液，序号10为空白图3实施例2方法检测不同批次PEG随机修饰门冬酰胺酶的PEG结合数图4实施例3方法检测PEG-ADI的PEG结合数具体实施方式本专利技术使用的术语解释如下：PEG定点修饰的门冬酰胺酶：制备方法参见专利申请号201410837456.3实施例1制备例1。每个门冬酰胺酶分子上可结合一个、两个或三个聚乙二醇，分别命名为PEG-ASP单修、PEG-ASP双修、PEG-ASP三修。采用的PEG修饰剂为Y-PALD-40K(购自厦门赛诺邦格科技有限公司)：分子量为40KD，是由两个直链的甲氧基聚乙二醇衍生物连接在中心核构成，其化学结构式为：PEG随机修饰的门冬酰胺酶：制备方法参见专利申请号201410837460.X实施例1制备例1。PEG随机修饰门冬酰胺酶的PEG结合数理论值在17-25个之间。采用的PEG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，包括以下步骤：待测样品处理的步骤、对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤、根据游离PEG含量推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数的步骤。

【技术特征摘要】
1.PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，包括以下步骤：待测样品处理的步骤、对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤、根据游离PEG含量推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数的步骤。2.权利要求1所述的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，其特征是待测样品处理步骤是将PEG修饰蛋白药物中的PEG完全从蛋白药物分子上释放出来；释放出来的PEG可以不带任何多肽或氨基酸，也可以连接有多肽或氨基酸。3.权利要求2所述的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，其特征是所述的待测样品处理步骤是采用了蛋白酶解方法将蛋白药物水解成多肽或氨基酸。4.权利要求2所述的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，其特征是所述的待测样品处理步骤是先用高温破坏PEG修饰蛋白的高级结构，然后用蛋白酶水解蛋白质成多肽或是氨基酸，释放出与蛋白结合的PEG。5.权利要求3或4所述的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，其特征是所述的蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶。6.权利要求1所述的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，其特征是对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤，是在处理后的样品和PEG对照品梯度溶液中，依次加入髙氯酸溶液、氯化钡溶液和碘溶液；混匀反映一定时间后，在波长535nm处测定吸光度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与吸光度值的标准曲线，并将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线，换算出处理后的样品中游离PEG的含量。7.权利要求1所述的PEG修饰蛋白中PEG结合数的检测方法，其特征是对处理后的样品测算游离PEG含量的步骤，是将处理后的样品和PEG对照品梯度溶液，加入到硫氰铁铵-氯仿两相体系中；测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值；据此确定PEG对照品梯度溶液的浓度与吸光度值的标准曲线，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，颜莎，王俊，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32