本发明专利技术涉及一种通用型嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。具体地，本发明专利技术提供了一种CAR‑T细胞，所述的表达嵌合抗原受体CAR，并且所述细胞HLA‑I类分子的α3区域与CD8分子的结合是被抑制的，所述细胞中的TCR基因表达是被沉默的。本发明专利技术的通用型CAR‑T细胞可以用于异体肿瘤治疗，且异体输注时不会引起GVHD及HVG反应，改善了异体CAR‑T细胞在受体体内的存活及抗肿瘤效果。
Preparation of universal chimeric antigen receptor T cells
The invention relates to a universal chimeric antigen receptor T cell, a preparation method and application thereof. Specifically, the present invention provides a CAR T cell expressing chimeric antigen receptor CAR, and the binding of the alpha 3 region of HLA class I molecule to CD8 molecule in the cell is inhibited, and the expression of TCR gene in the cell is silenced. The universal CAR T cells of the invention can be used for the treatment of allogeneic tumors, and the GVHD and HVG reaction will not be caused by the allogeneic infusion, thus improving the survival of allogeneic CAR T cells in the recipient body and the anti-tumor effect.
【技术实现步骤摘要】
通用型嵌合抗原受体T细胞制备技术
本专利技术涉及免疫细胞治疗领域，更具体地涉及一种通用型嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。嵌合免疫抗原受体(Chimericantigenreceptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chainvariablefragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出前所未有的疗效，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90％，对慢性淋巴细白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。此外，CAR-T细胞在治疗实体瘤方面也表现出很大的潜力。在传统的CART细胞治疗中，首先分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以非MHC限制方式识别。但这种治疗方式严重受制于患者的个体状况，分离改造细胞所造成的时间和金钱成本也非常高。因此，本领域仍然需要进一步的研究，开发一种可以大规模制备，质量均一稳定，随时可调用给任何患者的通用型CAR-T细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通用型嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种通用型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下特征：(a)所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物；和(b)所述CAR-T细胞HLA-I类分子的α3区域与CD8分子的结合是被抑制的。在另一优选例中，所述“α3区域与CD8分子的结合是被抑制的”指α3区域与CD8分子不结合或基本不结合。在另一优选例中，所述“基本不结合”指所述CAR-T细胞HLA-I类分子的α3区域与CD8分子的结合量C1与正常T细胞HLA-I类分子的α3区域与CD8分子的结合量C0的比值，即C1/C0≤0.05，较佳地C1/C0≤0.03，更佳地≤0.02，更佳地≤0.01，最佳地为0。在另一优选例中，所述的CD8分子来源于受体T细胞。在另一优选例中，所述的CD8分子来源于的TCR(Tcellreceptor)复合物。在另一优选例中，所述的α3区域被突变，从而使得α3区域与CD8分子的结合被抑制。在另一优选例中，所述的α3区域的第16-23位中有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个氨基酸被突变。在另一优选例中，所述的α3区域对应于HLA-Aα序列的第222-229位中有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个氨基酸被突变。在另一优选例中，所述的2个、3个、4个、5个、6个、7个氨基酸突变可以是连续的突变，也可以是不连续的突变。在另一优选例中，所述的α3区域的氨基酸序列如SEQIDNO.:7所示。在另一优选例中，所述的α3区域为HLA-A的α序列的α3区域。在另一优选例中，所述细胞中的HLA-I类分子的α3区域的基因表达是被沉默的。在另一优选例中，所述“α3区域的基因表达是被沉默的”指α3区域的基因不表达或低表达。在另一优选例中，所述“低表达”指所述CAR-T细胞α3区域的基因表达量G1与正常T细胞α3区域的基因表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。在另一优选例中，所述CAR-T细胞中的TCR基因表达是被沉默的。在另一优选例中，所述“TCR基因表达是被沉默的”指TCR基因不表达或低表达。在另一优选例中，所述“低表达”指所述CAR-T细胞TCR基因表达量M1与正常T细胞TCR基因表达量M0的比值，即M1/M0≤0.5，较佳地M1/M0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。在另一优选例中，所述的CAR的结构如下式I所示：L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为抗原结合结构域；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的L为GM-CSF。在另一优选例中，所述scFv为靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述scFV为靶向选自下组抗原的抗体单链可变区序列：CD19、CD20、CD22、CD123、CD47、CD138、CD33、CD30、mesothelin、EGFR、GPC3、BCMA、ErbB2、NKG2Dligands、LMP1、EpCAM、VEGFR-1、Lewis-Y、ROR1、Claudin18.2、或其组合。在另一优选例中，所述scFv为靶向CD19的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述scFv为FMC63，序列如SEQIDNO.:1第67-801位所示。在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的H为CD28来源的铰链区。在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。在另一优选例中，TM包括CD28来源的跨膜区。在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR或其组合。在另一优选例中，C包括CD28来源的共刺激信号分子。在另一优选例中，所述CAR的结构为L-FMC63-CD28-CD3ζ。在另一优选例中，所述CAR的序列如SEQIDNO.:2所示。在另一优选例中，所述的CAR-T细胞用于异体肿瘤治疗。在另一优选例中，所述的CAR-T细胞在异体治疗时不会引起GVHD及HVG反应。在本专利技术的第二方面，提供了一种制备本专利技术的第一方面所述的CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：(A)提供一待改造的T细胞；和(B)对所述的T细胞进行改造，从而使得所述的T细胞表达所述的CAR，并突变或沉默所述T细胞中HLA-I类分子的α3区域，使得α3区域与CD8分子的结合被抑制，从而获得本专利技术的第一方面所述的CAR-T细胞。在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述CAR的第一表达盒导入所述T细胞；和(B2)将表达用于突变或沉默α3区域的第二表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通用型嵌合抗原受体T细胞(CAR‑T细胞)，其特征在于，所述CAR‑T细胞具有以下特征：(a)所述CAR‑T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物；和(b)所述CAR‑T细胞HLA‑I类分子的α3区域与CD8分子的结合是被抑制的。
【技术特征摘要】
1.一种通用型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其特征在于，所述CAR-T细胞具有以下特征：(a)所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的标志物；和(b)所述CAR-T细胞HLA-I类分子的α3区域与CD8分子的结合是被抑制的。2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的α3区域被突变，从而使得α3区域与CD8分子的结合被抑制。3.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述细胞中的HLA-I类分子的α3区域的基因表达是被沉默的。4.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞中的TCR基因表达是被沉默的。5.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的CAR的结构如下式I所示：L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为抗原结合结构域；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹卫，刘丽萍，蔡松柏，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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