一种提高CAR-T细胞转染效率的方法技术

本发明专利技术属于肿瘤治疗技术领域，公开了一种提高CAR‑T细胞转染效率的方法。构建CAR质粒，保证质粒浓度在1500ng/ul以上；CAR质粒构建完成后，进行CAR脂质体构建；利用CAR质粒对慢病毒进行包装，48小时后收病毒；利用PBS对血液进行稀释，成分混匀，对PBMC细胞进行提取；在T细胞激活过程中进行感染，提取后PBMC加入CD3抗体包被的24孔板中过夜进行T细胞激活，而后进行电转、脂质体转染和慢病毒感染，6h后换液为正常培养基。本发明专利技术相比于电转、脂质体转染，慢病毒感染对T细胞而言有更高的效率；在T细胞激活过程中进行感染比激活前/激活后进行感染，CAR阳性感染的T细胞增多。

A method to improve the transfection efficiency of CAR-T cells

The invention belongs to the technical field of cancer treatment, and discloses a method for improving the transfection efficiency of CAR T cells. CAR plasmid was constructed to ensure the concentration of plasmid above 1500ng/ul; CAR liposome was constructed after the construction of CAR plasmid; lentivirus was packaged with CAR plasmid and received after 48 hours; PBS was used to dilute blood, homogenize components and extract PBMC cells; T cells were infected during activation, and PBMC was added to 24-well plate coated with CD3 antibody overnight after extraction. T cells were activated, then transfected by electroporation, liposome transfection and lentivirus infection. After 6 hours, the medium was changed into normal medium. Compared with electroporation and liposome transfection, lentivirus infection has higher efficiency for T cells, and the number of T cells infected with CAR positive is increased in the process of T cell activation compared with that infected before or after activation.

【技术实现步骤摘要】
一种提高CAR-T细胞转染效率的方法
本专利技术属于肿瘤治疗
，尤其涉及一种提高CAR-T细胞转染效率的方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：嵌合抗原受体修饰T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T)是目前肿瘤治疗研究的热门领域，它是过继免疫治疗的典型代表。通过利用基因转导技术，使T细胞表面可以稳定表达具有特异性识别肿瘤相关抗原能力的单链可变区片段(single-chainvariablefragment，scFv)，并与CD3ζ及其他T细胞共刺激分子如CD28/CD137之间相连接，通过非MHC限制性识别的方式，利用抗原抗体亲和力高、特异性强的特点，特异、高效地激活T细胞，进而对表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细胞产生杀伤效应，是目前较为成熟的、靶向性强、特异性高、杀瘤范围广、效果持久的治疗方式。在治疗急/慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等非实体瘤中展现出了极强的效果，大大提升了患者的生存期，减缓了复发，增加了患者缓解率90％，使用后患者的完全缓解生存时间可达2年。CAR在实体瘤的治疗中尚处于初期本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高CAR‑T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述的提高CAR‑T细胞转染效率的方法，具体包括以下步骤：步骤一：构建CAR质粒，保证质粒浓度在1500ng/ul以上；步骤二：CAR质粒构建完成后，进行CAR脂质体构建；步骤三：利用CAR质粒对慢病毒进行包装，48小时后收病毒；步骤四：利用PBS对血液进行稀释，成分混匀，对PBMC细胞进行提取；步骤五：在T细胞激活过程中进行感染，提取后PBMC加入CD3抗体包被的24孔板中过夜进行T细胞激活，而后进行电转、脂质体转染和慢病毒感染，6h后换液为正常培养基。

【技术特征摘要】
1.一种提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，具体包括以下步骤：步骤一：构建CAR质粒，保证质粒浓度在1500ng/ul以上；步骤二：CAR质粒构建完成后，进行CAR脂质体构建；步骤三：利用CAR质粒对慢病毒进行包装，48小时后收病毒；步骤四：利用PBS对血液进行稀释，成分混匀，对PBMC细胞进行提取；步骤五：在T细胞激活过程中进行感染，提取后PBMC加入CD3抗体包被的24孔板中过夜进行T细胞激活，而后进行电转、脂质体转染和慢病毒感染，6h后换液为正常培养基。2.如权利要求1所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述步骤二中，CAR脂质体构建，具体为：EP管1内：加入CAR质粒和100ulOpti-MEM中，加入5ulP3000充分混匀；EP管2内：100ulOpti-MEM+5ulLipo3000，管1和2混匀后室温下静置15min。3.如权利要求1所述的提高CAR-T细胞转染效率的方法，其特征在于，所述步骤三中，利用CAR质粒包装慢病毒，具体为：(1)EP管1内：5ugCAR质粒+3.75ugPSPAX2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡宗涛，吕东来，王宏志，
申请(专利权)人：中国科学院合肥肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：安徽,34