本发明专利技术的目的是提供一种插入H7N9的HA蛋白的新城疫病毒重组疫苗株,本发明专利技术通过对H7N9病毒HA蛋白的编码基因进行序列优化，解决了表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想的问题。制备的弱毒株免疫动物后均可以对当前流行的基因VII新城疫病毒提供良好的保护作用，同时可以提供对H9N2禽流感病毒侵害的防控。
A New Castle Disease Virus Recombinant Vaccine Strain Inserted with HA Protein of H7N9
The aim of the present invention is to provide a recombinant vaccine strain of Newcastle disease virus inserting HA protein of H7N9. By sequencing the coding gene of HA protein of H7N9 virus, the problem of low expression efficiency of recombinant virus expressing HA protein of avian influenza H7N9 virus, low level of induced antibody and unsatisfactory immunogenicity is solved. The prepared attenuated strains immunized animals can provide good protection against Newcastle disease virus VII, which is currently prevalent, and also provide protection against H9N2 avian influenza virus.
【技术实现步骤摘要】
一种插入H7N9的HA蛋白的新城疫病毒重组疫苗株
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种插入H7N9的HA蛋白的新城疫病毒重组疫苗株。技术背景世界动物卫生组织(OIE)规定的A类传染病中，高致病性禽流感(HPAI)和新城疫(ND)是其中的2种禽类烈性传染病。高致病性禽流感由H5或H7亚型禽流感病毒(AIV)引起，可导致感染禽群100％的死亡，每年给养殖业造成巨大的经济损失，尤其是近年流行的H7N9AIV，再次引起大家对禽流感的恐慌。H9亚型AIV属于低致病性禽流感病毒，感染鸡群的直接致死率不高，但传播迅速，可造成禽群的免疫抑制并继发其它疾病。新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的急性传染病，目前已在世界范围内发生了4次大流行，每次流行造成的损失难以估计。流行病学调查显示，当前流行的新城疫病毒主要是基因Ⅶ型。疫苗接种是预防禽流感和新城疫最有效的措施，但弱毒苗和灭活苗的免疫接种在临床上会干扰对这2种疾病的检测和流行病学调查，2种疫苗同时免疫还会增加家禽的免疫压力，且生产成本较高。新城疫病毒活载体疫苗的研究极大地推动了基因工程疫苗的发展，具有广阔的发展前景，可以真正实现一种疫苗预防2种重大疫病的目的。疫苗接种是预防禽流感和新城疫最有效的措施，但弱毒苗和灭活苗的免疫接种在临床上会干扰对这2种疾病的检测和流行病学调查，2种疫苗同时免疫还会增加家禽的免疫压力，且生产成本较高。虽然基因工程疫苗能够解决上述的问题，但与生产要求相比，还有一定的差距。因此获得免疫原性更好、诱导抗体效价更高、与流行毒株更匹配的重组毒株是目前生产急需解决的问题。但现有技术构建的表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种插入H7N9的HA蛋白的新城疫病毒重组疫苗株，通过反向遗传技术获得表达H7N9HA蛋白的重组NDV毒株作为疫苗的侯选株，从而弥补现有技术的不足本专利技术首先提供一种表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株,所述的病毒株的制备方法如下：1)构建新城疫病毒NDV全基因组转录质粒，所述的转录质粒，其中将核苷酸序列为SEQIDNO:2的H7N9的HA蛋白编码基因插入到新城疫病毒株NDV基因组的P基因与M基因之间；所述的将HA蛋白编码基因插入到新城疫病毒株NDV基因组的P基因与M基因之间，其一种方法是在新城疫病毒株NDV基因组的第3171nt之后引入PmeI酶切位点，再将核苷酸序列为SEQIDNO:2的H7N9HA蛋白编构建码基因插入到酶切位点处；2)构建用于表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的辅助重组质粒；3)将构建的新城疫病毒NDV全基因组转录质粒和3个辅助重组质粒共转染表达T7RNA聚合酶的细胞系，培养获得表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株。本专利技术再一个方面提供一种表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株，是用上述方法构建的；所获得的表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株用于制备疫苗。本专利技术另一个方面提供一种重组疫苗，其中使用的抗原为上述的表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株。本专利技术通过对H7N9病毒HA蛋白的编码基因进行序列优化，解决了表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想的问题。制备的弱毒株免疫动物后均可以对当前流行的基因VII新城疫病毒提供良好的保护作用，同时可以提供对H9N2禽流感病毒侵害的防控。附图说明图1：NDV基因组中PmeI酶切位点的引入图；图2：HA基因的PCR鉴定电泳图；图3：NDV毒株生长曲线的测定图。具体实施方式本专利技术通过前期建立的基因Ⅶ型NDV的反向遗传学操作平台，在构建的全基因组质粒基础上，分别在NDV的NP基因和P基因之间、P基因和M基因之间以及HN基因和L基因之间插入EGFP基因，拯救获得重组病毒。通过荧光观察和生长曲线测定等，确定EGFP基因在插入NDV的P基因和M基因之间时表达效率最高，且不影响毒株的增殖活性，因此选择P基因和M基因之间作为外源基因的插入位点。在P基因和M基因之间分别插入H9N2和H7N9的HA1、HA2及HA全长基因、HA部分截短基因，拯救获得重组毒株，免疫动物后发现，重组H9N2HA全长基因的毒株和重组H7N9HA截短基因的毒株免疫原性分别最好。因此选择H9N2HA全长基因、H7N9HA截短基因作为插入的目的基因。为了解决现有技术中构建的重组毒株免疫原性弱的问题，对H7N9的HA基因进行密码子优化，拯救获得重组HA基因的NDV弱毒株，包括HA基因经过密码子优化和未经过密码子优化的重组毒株，其中H7N9HA基因是截短基因，并做成活疫苗进行动物免疫，通过抗体效价测定发现，4株重组病毒中，2株经过密码子优化的重组病毒免疫动物后与未进行密码子优化的重组病毒相比，诱导的抗体水平明显提高，且与已经报道过的研究结果相比有明显优势；从而促成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1全长cDNA克隆载体的构建根据前期建立的全基因组载体构建方法，在P基因和F基因改造后的基础上，在分段连接的过程中，将片段2通过Over-lapPCR的方法进行改造，即在NDV全基因组序列3171nt之后引入PmeI酶切位点(图1)，构建的全基因组载体命名为PBRT-NDV-T。根据NCBI公布的H7N9的HA基因的序列(SEQIDNO:1):进行密码子优化并合成序列，合成的HA基因包括密码子优化和密码子未优化的序列。其中H7N9HA基因去掉头部的15bp碱基和尾部的33bp碱基，保留HA1蛋白和HA2蛋白中免疫原性较好的结构域，去掉部分信号肽和跨膜区序列；获得的优化后的H7N9HA基因的序列为SEQIDNO:2；设计引物，在扩增HA基因的上下游引物中分别添加PmeI酶切位点和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)及转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)，引物H7-F/H7-R扩增H7N9的HA基因。构建全长cDNA克隆载体，其中将构建的含含H7N9HA基因的载体分别命名为PBRT-NDV-2a(密码子进行优化，截短)和PBRT-NDV-2b(密码子未优化，截短)。引物和基因合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列见表1。CL2-2F/CL2-T7/CL2-T8/CL2-2R为引入PmeI酶切位点所用的引物。表1：NDV全基因组载体构建用引物序列实施例2重组病毒的拯救DF1-T7细胞接种于35mm六孔板内生长至70％-80％单层时，分别将转录质粒PBRT-NDV-2a、PBRT-NDV-2b与3个辅助质粒PCI-NP、PCI-P和PCI-L共转染DF1-T7细胞系，采用磷酸钙转染试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。转染3-5天后，收获培养物上清接种9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔，培养3-5天，取鸡胚尿囊液测HA效价。收获HA试验结果阳性尿囊液，分装后-70℃冻存。将拯救的含H7N9HA基因的重组NDV命名为rNDV-H7a(密码子优化，截短)和rNDV-H7b(密码子未优化，截短)。将第一代转染液接胚后4天收获尿囊液，血凝(HA)试验阴性；收取的尿囊液1:10稀释，继续接胚盲传，0.1mL/枚，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株的构建方法，其特征在于，所述的构建方法如下：1)构建新城疫病毒NDV全基因组转录质粒，所述的转录质粒，其中将H7N9的HA蛋白编码基因插入到新城疫病毒株NDV基因组的P基因与M基因之间；2)构建用于表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的辅助重组质粒；3)将构建的新城疫病毒NDV全基因组转录质粒和3个辅助重组质粒共转染表达T7RNA聚合酶的细胞系DF1‑T7，培养获得表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株。
【技术特征摘要】
1.一种表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株的构建方法，其特征在于，所述的构建方法如下：1)构建新城疫病毒NDV全基因组转录质粒，所述的转录质粒，其中将H7N9的HA蛋白编码基因插入到新城疫病毒株NDV基因组的P基因与M基因之间；2)构建用于表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的辅助重组质粒；3)将构建的新城疫病毒NDV全基因组转录质粒和3个辅助重组质粒共转染表达T7RNA聚合酶的细胞系DF1-T7，培养获得表达禽流感H7N9病毒HA蛋白的新城疫病毒株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将HA蛋白编码基因插入...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明义，李朝阳，孙化露，刘阳，单学强，于泽坤，李思菲，栾志舫，只勇，孙娜娜，颜瑞娟，胡秀香，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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