一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒。该重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，实验第1天，向1日龄SPF鸡颈部皮下接种重组火鸡疱疹病毒；实验第35天，鼻腔接种BJ/15病毒株；实验第38天和第40天，SPF鸡的口腔和泄殖腔均不排毒，BJ/15病毒株不能够在SPF鸡的脏器(如内脏器官、气管、肺、脾和肾脏)中有效复制。由此可见，重组火鸡疱疹病毒对H9N2亚型AIV具有优良的免疫保护效果。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒。
技术介绍
1994年，我国首次报道鸡感染H9N2亚型禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)疫情，自此H9N2亚型AIV在我国家禽中广泛流行，该病毒感染鸡群之后导致蛋鸡产蛋下降或者引起继发感染，给养殖业带来巨大经济损失。H9N2亚型AIV在陆生禽类中流行并演化成为不同的基因型，目前H9N2亚型AIV在我国鸡群中优势流行株是G57基因型，该基因型最早出现在2007年，2010年以后成为优势基因型；该基因型的H9N2亚型AIV不仅严重威胁养殖业健康发展，同时作为基因供体，在H7N9、H10N8等新型流感病毒产生中起到重要作用，给禽流感病毒的防控带来巨大挑战。针对H9N2亚型AIV，自1998年以来，我国实行灭活疫苗免疫防控策略。但是灭活疫苗存在许多固有的缺陷，其只能刺激机体产生体液免疫，而不能产生有效的细胞免疫，同时灭活疫苗产生免疫保护主要是通过其较高的血清抗体水平，由于灭活疫苗产生的抗体维持时间短，需要持续的多次免疫来维持较高的抗体滴度，这样给养殖人来带来巨大的工作量，同时过多的免疫造成机体免疫疲劳，降低免疫效果，进而降低生产性能。灭活疫苗产生抗体所需时间较长，易错过最佳保护时机。因此在过去的20年时间里，灭活疫苗能够减轻感染鸡临床症状，降低鸡排毒，却不能产生完全保护，同时由于病毒抗原性的变异，导致没有有效控制H9N2亚型AIV的流行。对近年来H9N2亚型AIV在免疫鸡群中的流行情况进行调查发现，H9N2亚型AIV的分离率逐年上升，从2010年的22.08％上升到2013年的47.08％，表明传统的灭活疫苗免疫不能有效的防控H9N2亚型AIV感染，因此新疫苗的研发迫在眉睫。活载体疫苗能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，成为新疫苗研制的热点。火鸡疱疹病毒(Turkeyherpesvirus，HVT)属于疱疹病毒科，1970s年代分离以来一直作为免疫防控马立克氏病(MD)的疫苗毒株被广泛使用。HVT可以容纳外源基因并携带外源基因进行复制，是目前活载体疫苗研究的热门。自1970年以来，HVTFC126株己成为全球范围内用于预防MD的主要疫苗。HVT为双链DNA病毒，基因组大，存在许多复制非必需区，可以承载外源基因在体内复制并表达。同时还具有如下优点：HVT可在鸡体内持续感染，刺激机体持续产生抗体，接种一次即可达到终生免疫的效果；HVT作为疫苗对鸡无致病性，不影响其生产性能，安全性好；HVT可刺激机体产生较强的细胞免疫反应，且持续时间长，接种一次即可达到终生免疫的效果；HVT具有很强的细胞结合特性，可在细胞间传播，突破母源抗体的干扰等。因此，HVT为载体的基因工程疫苗具有广阔的应用前景。目前，以HVT作为载体成功表达许多禽类病毒的免疫保护性抗原，如传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)及艾美尔球虫病(Eimeria)等，这些HVT重组疫苗不仅可以同时诱导禽类产生针对病毒载体和外源病毒的免疫保护力，起到预防多种疾病的效果，而且重组病毒在体内产生的免疫应答反应持久、潜伏期短。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备预防禽流感病毒和马立克病毒的疫苗。本专利技术首先保护一种重组火鸡疱疹病毒；所述重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白可为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因可为如下c1)或c2)或c3)：c1)序列表的序列1所示的DNA分子；c2)与c1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的DNA分子；c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA分子杂交且编码所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的DNA分子或cDNA分子。所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白来源于名称为A/Chicken/Beijing/0701/2015(H9N2)的禽流感病毒病毒株，该病毒株具体由本专利技术的专利技术人从北京市活禽市场采集鸡的咽喉拭子样本，参考文献(Pujuanetal.EvolutionoftheH9N2influenzagenotypethatfacilitatedthegenesisofthenovelH7N9virus.ProcNatlAcadSciUSA.2015.)中的记载的方法分离和鉴定获得。上述任一所述的重组火鸡疱疹病毒中，所述改造的实现方式可为：向出发火鸡疱疹病毒的基因组UL区的95322nt-95323nt之间插入特异DNA分子；所述特异DNA分子中可含有启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和终止子。所述特异DNA分子中还可含有增强子；所述增强子可位于所述启动子的上游。上述任一所述特异DNA分子自上游至下游依次可含有所述增强子、所述启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和所述终止子。上述任一所述增强子可为CMV增强子。所述CMV增强子可为序列表中序列3自5’末端起第1至274位所示的DNA分子。上述任一所述启动子可为鸡β-肌动蛋白启动子。所述鸡β-肌动蛋白启动子可为序列表中序列3自5’末端起第275至561位所示的DNA分子。上述任一所述终止子可为bGH终止子。所述bGH终止子可为序列表中序列3自5’末端起第2350至2573位所示的DNA分子。上述任一所述特异DNA分子可为序列表的序列3所示的DNA分子。上述任一所述出发火鸡疱疹病毒具体可为HVTFC-126疫苗株。上述任一所述特异DNA分子也属于本专利技术保护的保护范围。上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白也属于本专利技术保护的保护范围。上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因也属于本专利技术保护的保护范围。本专利技术还保护X1)或X2)或X3)或X4)。X1)上述任一所述重组火鸡疱疹病毒在预防禽流感病毒和/或马立克病毒中的应用也属于本专利技术的保护范围。X2)上述任一所述重组火鸡疱疹病毒在制备用于预防禽流感病毒和/或马立克病毒的疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。X3)上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白、或、上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因、或、上述任一所述特异DNA分子在预防禽流感病毒中的应用也属于本专利技术的保护范围。X4)上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白、或、上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因、或、上述任一所述特异DNA分子在制备用于预防禽流感病毒的疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护一种预防禽流感病毒和/或马立克病毒的疫苗，其可含有上述任一所述重组火鸡疱疹病毒。所述预防禽流感病毒和/或马立克病毒的疫苗具体是以上述任一所述重组火鸡疱疹本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。2.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因为如下c1)或c2)或c3)：c1)序列表的序列1所示的DNA分子；c2)与c1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的DNA分子；c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA分子杂交且编码所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的DNA分子或cDNA分子。3.如权利要求1或2所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述改造的实现方式为：向出发火鸡疱疹病毒的基因组UL区的95322nt-95323nt之间插入特异DNA分子；所述特异DNA分子中含有启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和终止子。4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，刘立涛，孙洪磊，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11