一种核壳结构的磁性固定化酶载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物化学领域，具体公开了一种核壳结构的磁性固定化酶载体及其制备方法和应用，制备方法包括：将四氧化三铁纳米颗粒加入到含有多巴胺的Tris‑HCl缓冲溶液中，在20～30℃条件下搅拌8～24h，洗涤、烘干后得到四氧化三铁多巴胺核颗粒；再将四氧化三铁多巴胺核颗粒、氯化锆、月桂酸溶于有机溶剂，超声后加入氨基对苯二甲酸，在75～85℃条件下保温1～3h后升温到100～120℃保温10～24h，经过后处理，得到的磁性固定化酶载体易于分离、可重复利用、酶载量高；将制备得到的磁性固定化酶载体应用于酰胺酶的固定化中，可以使得到的固定化酰胺酶的酶活回收率高、热稳定性和有机溶剂耐受性好。

A magnetic immobilized enzyme carrier with core-shell structure and its preparation method and Application

The invention belongs to the field of biochemistry, and specifically discloses a magnetic immobilized enzyme carrier with core-shell structure and its preparation method and application. The preparation method includes: adding ferric oxide nanoparticles into Tris_HCl buffer solution containing dopamine, stirring for 8-24 hours at 20-30 C, washing and drying to obtain ferric oxide dopamine core particles; and then adding ferric oxide nanoparticles to Tris_HCl buffer solution containing dopamine; Iron dopamine nuclear particles, zirconium chloride and lauric acid were dissolved in organic solvents. Amino-terephthalic acid was added after ultrasonic treatment. The magnetic immobilized enzyme carrier was easily separated, reusable and high enzyme loading after heat preservation for 1-3 hours at 75-85 C and 10-24 hours at 100-120 C. The magnetic immobilized enzyme carrier was used for immobilization of amidase. The immobilized amidase has high activity recovery, thermal stability and good tolerance to organic solvents.

【技术实现步骤摘要】
一种核壳结构的磁性固定化酶载体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种核壳结构的磁性固定化酶载体及其制备方法和在酰胺酶固定化中的应用。
技术介绍
固定化酶因具有高稳定性、易于产物分离、可循环使用等优点，在生物催化、生物检测等领域得到广泛的应用和发展。酶固定化技术的关键因素之一是固定化载体的筛选和制备。载体的材质和结构对固定化酶的催化性能、稳定性具有重要的影响。因此，开发一种高催化活力、高稳定性的固定化载体在酶固定化和生物催化领域具有重要应用价值。近年来，随着材料科学及纳米技术的迅速发展，各种新型载体如无机多聚材料、多孔硅(ACS.Appl.Mater.Inter.,2014,6,2622-2628)、纳米凝胶、碳纳米载体(J.Ind.Eng.Chem.,2013,19,279-285)、磁性纳米复合材料载体已被广泛地应用于酶的固定化。但是，上述多孔材料由于孔径限制易使传质受限，导致底物与酶活性中心接触障碍；上述纳米凝胶载体制备复杂、条件控制严格，且不易后续分离和重复使用。其中，磁性纳米复合材料载体由于可以提高固定化酶在溶液中的分散性，同时有效提高共价固定化酶的稳定性，已被大量研究。中国专利文献CN103525805公开了一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法，包括合成磁性Fe3O4纳米颗粒；制备核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米复合物；制备锐钛矿型Fe3O4@TiO2纳米复合物，对纳米复合物表面进行功能化修饰从而得到Fe3O4@TiO2固定化酶载体，上述制备方法繁琐，且得到的固定化酶载体的载酶量较低，其载酶的稳定性也有待进一步提高。金属有机框架(Metal-OrganicFrameworks)，简称MOFs，是由有机配体和金属离子或者团簇通过配位键自组装形成的具有分子内空隙的有机-无机杂化材料，广泛应用于催化、吸附、生物分离、载药等领域。MOFs具有合成简单、比表面积大、结构多样和易于功能化修饰等特点，是一种理想的固定化酶载体。但是，目前报道的大多数金属有机框架材料孔径需要改善才能用于固定化，并且分离方法也需要改进。因此，本专利技术在改善金属有机框架的基础上，结合磁性材料所构建的新型磁性金属有机框架在酶固定化领域具有重大的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，得到的磁性固定化酶载体生物相容性好、可重复利用、酶载量高，还可以应用于酰胺酶固定化中，应用得到的固定化酰胺酶的酶活回收率高、稳定性好。本专利技术的技术方案如下：一种核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将四氧化三铁纳米颗粒加入含多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，搅拌、洗涤、烘干后得到四氧化三铁多巴胺核颗粒；(2)将步骤(1)得到的四氧化三铁多巴胺核颗粒与氯化锆以及月桂酸混合溶于有机溶剂，超声得到混合溶液；再向混合溶液中加入氨基对苯二甲酸，在75～85℃条件下保温1～3h后升温到100～120℃保温10～24h，再经过后处理，得到所述磁性固定化酶载体。本专利技术以Fe3O4磁性纳米颗粒作为载体的核，并进行表面包裹多巴胺薄层以及外层合成金属有机框架(Hp-UiO-66-NH2)，进而合成多层次核壳结构的磁性固定化酶载体。本专利技术在合成磁性多巴胺纳米颗粒的基础上，利用调制剂诱导缺陷形成，通过将金属前驱体氯化锆与过量的调制剂月桂酸混合，再加入不足量的有机配体氨基对苯二甲酸来替代调制剂，最后通过后处理除去调制剂，形成具有调制剂介孔缺陷框架结构，增加了金属有机框架的孔径，得到相对稳定的多级孔金属有机框架。多级孔金属有机框架利用其增加的孔径使得其作为酶载体有利于酶的加载，增加了载体的酶载量，同时外壳多层次金属有机框架上引入的氨基可以与酶蛋白表面上氨基共价交联进而将酶稳定的固定在磁性多级金属有机框架载体上，使得所得到的固定化酶稳定性好。步骤(1)中，所述多巴胺溶液的浓度为1～5mg/mL，优选为1～2mg/mL，这是由于所述浓度的多巴胺溶液可以在纳米颗粒表面涂覆一定厚度的多巴胺涂层，既能达到螯合金属目的，又能使得纳米颗粒保留较好的磁场强度，有利于后续分离。步骤(2)中，所述的氨基对苯二甲酸、氯化锆、月桂酸以及四氧化三铁多巴胺核颗粒的质量比为1:2～6:50～80:60～100，质量比进一步优选为1:2～4:60～70:65～75，合成获得的多孔有机框架孔径最大，有利于后续载酶。步骤(2)中，所述的后处理方法为：将得到的产物用外部磁铁分离，洗涤后溶于含浓盐酸的有机溶剂中70～90℃保温10～24h，洗涤烘干得到所述磁性固定化酶载体，上述后处理方法可以充分地活化所得到的产物并将反应体系中的竞争性配体除去。其中，所述浓盐酸的质量百分比浓度为0.1％～0.5％。步骤(1)和步骤(2)中，所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。本专利技术还公开了一种由上述方法制备的核壳结构的磁性固定化酶载体以及所述磁性固定化酶载体在酰胺酶固定化中的应用。所述的应用方法具体为：将所述磁性固定化酶载体分散于缓冲液中，超声得到悬浮液；再向悬浮液中加入酰胺酶和硫酸铵，搅拌均匀后加入0.1％～2.0％的戊二醛溶液并在0～5℃下震荡1～5h，最后用外部磁铁分离，洗涤、冷冻、干燥后得到固定化酰胺酶。所述的酰胺酶与磁性固定化酶载体的质量比为1:2～7。所述缓冲液的pH值为5.0～9.0，优选地，所述缓冲溶液为pH7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，在此条件下能较好的保留游离酶活性。所述硫酸铵终浓度为30％～80％，优选为50％的饱和硫酸铵终浓度，这个浓度下所得到的固定化酰胺酶的酶活回收率较高。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本专利技术制备固定化酶载体的方法简单、反应条件温和、易于操作；(2)本专利技术的固定化酶载体具有较好的生物相容性，同时具有易于分离、可重复利用、酶载量高的优势，是一种理想的固定化酶载体；(3)本专利技术将磁性固定化酶载体应用于酰胺酶的固定化中，可以使得到的固定化酰胺酶的酶活回收率高、热稳定性和有机溶剂耐受性好。附图说明图1为本专利技术制备核壳结构的磁性固定化酶载体的流程图；图2为实施例1制备的四氧化三铁多巴胺核颗粒和磁性固定化酶载体的扫描电镜图和透射电镜图；图3为实施例1制备的四氧化三铁纳米颗粒、四氧化三铁多巴胺核颗粒和磁性固定化酶载体的红外光谱图；图4为实施例1制备的四氧化三铁纳米颗粒、四氧化三铁多巴胺核颗粒和磁性固定化酶载体的X衍射光谱图；图5为实施例1制备的四氧化三铁纳米颗粒、四氧化三铁多巴胺核颗粒和磁性固定化酶载体的磁滞曲线；图6为应用例4制备的固定酰胺酶的热稳定性示意图；图7为应用例5制备的固定酰胺酶有机溶剂稳定性示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1(1)将80mL乙二醇、1.5g聚乙二醇、1.3g三氯化铁、6.0g醋酸钠、1.0g柠檬酸钠和75μL蒸馏水依次加入到100mL的圆底烧瓶，并在室温下磁力搅拌30min形成均匀透明溶液；再将溶液转移到100mL反应釜，在180℃保温3h，升温至200℃保温9h，冷却至室温，用无水乙醇和蒸馏水多次洗涤，最后在50℃条件下真空烘干，得到四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4)；(2)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将四氧化三铁纳米颗粒加入含多巴胺的Tris‑HCl缓冲溶液中，搅拌、洗涤、烘干后得到四氧化三铁多巴胺核颗粒；(2)将步骤(1)得到的四氧化三铁多巴胺核颗粒与氯化锆以及月桂酸混合溶于有机溶剂，超声得到混合溶液；再向混合溶液中加入氨基对苯二甲酸，在75～85℃条件下保温1～3h后升温到110～130℃保温10～24h，再经过后处理，得到所述磁性固定化酶载体。

【技术特征摘要】
1.一种核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将四氧化三铁纳米颗粒加入含多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，搅拌、洗涤、烘干后得到四氧化三铁多巴胺核颗粒；(2)将步骤(1)得到的四氧化三铁多巴胺核颗粒与氯化锆以及月桂酸混合溶于有机溶剂，超声得到混合溶液；再向混合溶液中加入氨基对苯二甲酸，在75～85℃条件下保温1～3h后升温到110～130℃保温10～24h，再经过后处理，得到所述磁性固定化酶载体。2.如权利要求1所述的核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多巴胺溶液的浓度为1～5mg/mL。3.如权利要求1所述的核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的氨基对苯二甲酸、氯化锆、月桂酸以及四氧化三铁多巴胺核颗粒的质量比为1:2～6:50～80:60～100。4.如权利要求1所述的核壳结构的磁性固定化酶载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，林超平，汤晓玲，吴哲明，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33