羊栖菜抗衰老多糖的提取方法技术

本发明专利技术公开了羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，大孔树脂纯化步骤为：将抗衰老粗多糖溶液调配后上样至大孔树脂D3520‑Cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用。有益效果为：本发明专利技术羊栖菜抗衰老多糖的提取方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，色素去除率高。

Extraction of anti-aging polysaccharide from Sargassum fusiforme

The invention discloses a method for extracting anti-aging polysaccharide from Sargassum fusiform, including preparation of alginate polysaccharide extract, macroporous resin purification, ion exchange chromatography, dialysis and gel column purification. Macroporous resin purification steps are as follows: after mixing the anti-aging polysaccharide solution, the sample is purified onto macroporous resin D3520 Cl column, and then eluted with deionized water, and the collected eluent is decompressed. Shrinkage to a viscous state, then add ethanol solution to the concentrated solution, mix evenly, precipitate overnight, centrifuge, dry, reserve. The beneficial effect is that the extraction method of the anti-aging polysaccharide from Sargassum fusiforme is simple and feasible, the extraction efficiency, yield and purity of the polysaccharide are high, and the pigment removal rate is high.

【技术实现步骤摘要】
羊栖菜抗衰老多糖的提取方法
本专利技术涉及多糖提取
，尤其是涉及羊栖菜抗衰老多糖的提取方法。
技术介绍
多糖（polysaccharide）广泛存在于动植物和微生物等有机体中，是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，它是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的高分子化合物。一般植物多糖由成百上千个单糖组成，由于单糖的种类和连结方式以及异头碳的构型都会影响多糖的结构，因此从自然界获得到的多糖在结构上远比蛋白质和核酸的结构要复杂很多。进入20世纪90年代后，多糖及复合物的分离纯化、组分测定和结构分析等方面的研究有了长足进步，同时由于细胞生物学和分子生物学的发展，研究发现了糖类化合物特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、信号传达、免疫与应答、细胞转化和分化都离不开糖链的参与。由于糖复合物的种种功效，其研究也成为生命科学研究领域的新前沿。大量研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血糖、抗氧化和免疫等活性，且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此在临床和功能食品上得到了广泛使用，相关多糖生物资源的研究和开发利用受到海内外科学家的日益关注，成为天然药物研发、生物化学等领域的研究热点。羊栖菜系褐藻门马尾藻科马尾藻属植物，别名玉草、海草、六角菜，作为药食两用经济海藻，有“长寿菜”美称，被推崇为益寿食品。多糖是羊栖菜中含量最多的特色成分，约占其干重的45%-65%。研究表明，除作为膳食纤维调理胃肠功能、调节机体对脂类和糖类等的代谢作用外，羊栖菜多糖还具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫等生物活性。这些作用能够直接或间接地改善人体健康状况，降低有害刺激对机体的损伤，减缓与衰老相关疾病的进程。由此推测，多糖是羊栖菜发挥抗衰老作用的有效成分。目前，羊栖菜多糖提取技术主要有酶解法、碱解法、酸解法、水提取法、超声波辅助，但现有羊栖菜多糖的提取方法中，都存有不足，包括成本太高，操作复杂，耗能耗材较多，多糖含量和纯度不高等。最重要的是：多糖粗提取物往往是复杂的混合物，既包括分子量不同、结构不同的多糖片段，又包括蛋白质、色素等物质。因此需要对其进行分离纯化处理。现有技术如授权公告号为CN105601762B的中国专利技术专利，公开了一种操作步骤简单、耗能耗材少、多糖含量及纯度较高的羊栖菜多糖的提取方法，包括如下步骤：(1)烘干羊栖菜，粉碎成粉，过40-200目筛网；(2)将步骤(1)中得到的羊栖菜藻粉和95%乙醇充分混合，进行回流脱脂；(3)回收步骤(2)中脱脂后的藻粉，加入蒸馏水，通过绢筛进行过滤多次收集滤液，合并上述滤液，进行减压浓缩，得到浓缩液；(4)步骤(3)中浓缩液，按照浓缩液，加入95%乙醇，醇沉后，离心，收集沉淀，加入蒸馏水，搅拌至完全溶解；(5)将步骤(4)中的多糖溶液，冷冻真空干燥，得到多糖产物。但是该羊栖菜多糖的纯度均较低，色泽较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提取方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，色素去除率高的羊栖菜抗衰老多糖的提取方法。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，具体步骤为：抗衰老粗多糖制备：将羊栖菜粉利用浓度为93-97%的乙醇溶液回流1.5-2.5h，重复回流2-4次，除去色素、去脂以及去单糖，然后加入28-33倍量蒸馏水和羊栖菜粉重量0.03-0.05‰乳酸钙，在80-90℃、功率为120-170W下超声辅助提取2.5-3.5h，过滤，滤液即为抗衰老粗多糖溶液，利用超声波作用产生空化效应，在组织细胞内形成高压，高压的释放在溶液中形成强大的冲击波，能够有效地减小、消除水与羊栖菜之间的阻力，从而加大了传质效率，同时细胞组织受到冲击波产生的物理剪切力而变形破裂，释放出胞内物质，大大加速了提取过程，且由于抗衰老多糖是极性的，不溶于乙醇溶液，因此利用乙醇溶液使抗衰老多糖形成沉淀，从而使多糖与水溶性单糖等其他物质分离；大孔树脂纯化：将抗衰老粗多糖溶液调配成浓度3-5mg/mL的溶液后上样至大孔树脂D3520-Cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用，该步骤用D3520-Cl在其中引入了具有较高活性的氯甲基(−CH2Cl)，提高了非极性大孔树脂D3520的极性，使得抗衰老多糖中的色素和蛋白质易于进入D3520-Cl的内部，与其内部的活性位点产生吸附作用，从而提高其吸附量，可以有效能够除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度，同时可有效保护多糖的结构和活性；离子交换层析：将大孔树脂纯化后的多糖用去离子水配成浓度18-22mg/mL的溶液，上样至DEAESepharoseCL-6B柱进行离子交换层析纯化，分别用0mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，不同浓度的氯化钠溶液洗脱体积为3-4BV，洗脱的流速设置成0.7-0.8mL/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量，样品直到没有SFPS可以检出就可以，绘制洗脱曲线，分别收集各洗脱峰区间的洗脱液，经大孔树脂纯化后的多糖仍含有一定量的杂质，该步骤用DEAESepharoseCL-6B具有三维空间网状结构，不但具有离子交换作用，而且具有分子筛的作用，其分离多糖相对分子量的范围位于10kDa-4000kDa之间，使得该步骤可根据电荷和分子量的不同达到的双重分离效果，使多糖溶液实现浓缩和初步纯化，具有非常好的分离效能；透析：将离子交换层析后的洗脱液用截留分子量为3000-4000Da透析袋透析至袋外溶液的电导率与去离子水的电导率相同，透析液冷冻干燥，备用，经盐溶液洗脱后的多糖中含有无机盐、低聚糖以及部分色素等杂质，若直接将回收液进行乙醇沉淀，大量的盐分会同时随多糖被沉淀下来，影响后续多糖的纯度和活性研究，因此选择简便有效的透析袋进行多糖的除盐；凝胶色谱柱纯化：将透析得到的多糖粗品配成浓度38-42mg/mL的溶液，分别上样至SephadexG-200凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，通过紫外-可见分光光度计跟踪检验其在480nm处的吸光度，分别以洗脱液的体积和吸光度为横纵坐标绘制洗脱曲线，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩至小体积，冷冻干燥，即得抗衰老多糖，用离子交换树脂分离各级多糖的依据是其所带电荷量的不同，所以各级分多糖很可能是带电荷量相同的几种多糖的混合物，而凝胶层析的原理是根据待分离物质分子量的大小进行分离的，能够获得高纯度的羊栖菜抗衰老多糖。作为优选，大孔树脂纯化步骤用D3520-Cl的制备步骤为：将大孔树脂D3520用浓度为93-97%的乙醇溶液溶胀5-6h，随后用浓度为93-97%的乙醇溶液清洗2-4遍后自然风干，然后按固液比为1:3.5-4.0（g/mL）将D3520置于60-70℃的CCl4中溶胀30-40h，再加入ZnCl2、柠檬酸铁、NaCl以及氯甲醚，在温度为45-55℃、超声功率为70-80W的条件下反应21-26h，即得D3520-Cl。该步骤采取超声加热作用对D3520氯甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，其特征在于：所述大孔树脂纯化步骤为：将抗衰老粗多糖溶液调配后上样至大孔树脂D3520‑Cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用。

【技术特征摘要】
1.羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，包括褐藻粗多糖提取液制备、大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，其特征在于：所述大孔树脂纯化步骤为：将抗衰老粗多糖溶液调配后上样至大孔树脂D3520-Cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用。2.根据权利要求1所述的羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，其特征在于：所述抗衰老粗多糖溶液调配成浓度3-5mg/mL的溶液。3.根据权利要求1所述的羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，其特征在于：所述D3520-Cl的制备步骤为：将大孔树脂D3520用乙醇溶液溶胀5-6h，随后用乙醇溶液清洗2-4遍后自然风干，然后按固液比为1:3.5-4.0（g/mL）将D3520置于60-70℃的CCl4中溶胀30-40h，再加入ZnCl2、柠檬酸铁、NaCl以及氯甲醚，在温度为45-55℃、超声功率为70-80W的条件下反应21-26h，即得D3520-Cl。4.根据权利要求3所述的羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，其特征在于：所述D3520、ZnCl2、NaCl和氯甲醚的重量比为1:1.3-1.5:0.40-0.42:0.15-0.17，所述ZnCl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.12-0.13。5.根据权利要求1所述的羊栖菜抗衰老多糖的提取方法，其特征在于：所述抗衰老粗多糖制备步骤为：将羊栖菜粉利用浓度为93-97%的乙醇溶液回流1.5-2.5h，重复回流2-4次，然后加入28-33倍量蒸馏水和羊栖菜粉重量0.03-0...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢晓丹，
申请(专利权)人：浦江县昂宝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33