一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，包括大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，大孔树脂纯化步骤用大孔树脂为D3520‑Cl，具体为：将粗多糖进行大孔树脂纯化，经收集的洗脱液的浓缩液醇沉，离心，干燥；将大孔树脂纯化后的多糖溶液进行离子交换层析纯化，将收集各洗脱峰区间的洗脱液进行透析，冷冻干燥；将透析得到的多糖粗品溶液上样至凝胶柱进一步纯化，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩，冷冻干燥得抗衰老多糖。有益效果为：本发明专利技术抗衰老多糖的纯化方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，大孔树脂纯化步骤用大孔树脂具有较高活性的氯甲基、吸附量高。

Purification of anti-aging polysaccharide from Sargassum fusiforme

The invention discloses a purification method for Sargassum fusii anti-aging polysaccharide, which comprises macroporous resin purification, ion exchange chromatography, dialysis and gel column purification, and macroporous resin purification steps using macroporous resin as D3520 Cl, which is to purify macroporous polysaccharides by macroporous resin, alcohol precipitation, centrifugation and drying after collecting concentrated liquid of eluent, and then purify macroporous resin. The liquid was purified by ion-exchange chromatography, and the eluent of each elution peak interval was collected for dialysis and freeze drying. The crude polysaccharide solution obtained from dialysis was further purified to gel column, and eluent of each elution peak area was collected, and the components with the best anti-aging effect were selected, concentrated and frozen dried to obtain anti-aging polysaccharides. The beneficial effect is that the purification method of the anti-aging polysaccharide of the invention is simple and feasible, the extraction efficiency, yield and purity of the polysaccharide are high, and the macroporous resin used in the purification step of the macroporous resin has high activity of chloromethyl and high adsorption capacity.

【技术实现步骤摘要】
一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法
本专利技术涉及多糖提取
，尤其是涉及一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法。
技术介绍
多糖（polysaccharide）广泛存在于动植物和微生物等有机体中，是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，它是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的高分子化合物。一般植物多糖由成百上千个单糖组成，由于单糖的种类和连结方式以及异头碳的构型都会影响多糖的结构，因此从自然界获得到的多糖在结构上远比蛋白质和核酸的结构要复杂很多。进入20世纪90年代后，多糖及复合物的分离纯化、组分测定和结构分析等方面的研究有了长足进步，同时由于细胞生物学和分子生物学的发展，研究发现了糖类化合物特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、信号传达、免疫与应答、细胞转化和分化都离不开糖链的参与。由于糖复合物的种种功效，其研究也成为生命科学研究领域的新前沿。大量研究表明，多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血糖、抗氧化和免疫等活性，且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，因此在临床和功能食品上得到了广泛使用，相关多糖生物资源的研究和开发利用受到海内外科学家的日益关注，成为天然药物研发、生物化学等领域的研究热点。羊栖菜系褐藻门马尾藻科马尾藻属植物，别名玉草、海草、六角菜，作为药食两用经济海藻，有“长寿菜”美称，被推崇为益寿食品。羊栖菜多糖主要包括褐藻酸、褐藻淀粉和褐藻糖胶，羊栖菜多糖是羊栖菜中含量最多的特色成分，约占其干重的45%-65%，羊栖菜多糖除作为膳食纤维调理胃肠功能、调节机体对脂类和糖类等的代谢作用外，还具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫等生物活性。这些作用能够直接或间接地改善人体健康状况，降低有害刺激对机体的损伤，减缓与衰老相关疾病的进程。目前，羊栖菜多糖提取技术主要有酶解法、碱解法、酸解法、水提取法、超声波辅助，但现有羊栖菜多糖的提取方法中，都存有不足，包括成本太高，操作复杂，耗能耗材较多，多糖含量和纯度不高等。最重要的是：多糖粗提取物往往是复杂的混合物，既包括分子量不同、结构不同的多糖片段，又包括蛋白质、色素等物质。因此需要对其进行分离纯化处理。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种纯化方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，大孔树脂纯化步骤用大孔树脂具有较高活性的氯甲基、吸附量高的羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，包括大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，其中大孔树脂纯化步骤用大孔树脂为D3520-Cl。本专利技术用D3520-Cl在其中引入了具有较高活性的氯甲基(−CH2Cl)，提高了非极性大孔树脂D3520的极性，使得抗衰老多糖中的色素和蛋白质易于进入D3520-Cl的内部，与其内部的活性位点产生吸附作用，从而提高其吸附量，有效提高多糖的纯度、改善多糖的感官效果。作为优选，D3520-Cl的制备步骤为：将大孔树脂D3520用浓度为93-97%的乙醇溶液溶胀5-6h，随后用浓度为93-97%的乙醇溶液清洗2-4遍后自然风干，然后置于60-70℃的CCl4中溶胀30-40h，再加入ZnCl2、柠檬酸铁、NaCl以及氯甲醚，在温度为45-55℃、超声功率为70-80W的条件下反应16-20h，即得LX1180-Cl。该步骤采取超声加热作用对D3520氯甲基化改性，可以增加树脂的溶胀度，使D3520中部分塌陷孔重新打开，增加D3520中活性位点的数目，且超声加热作用增加了反应体系的能量，这将增加活性分子数目和降低扩散层厚度，最终增加氯甲基化反应的速度和程度，使得到的大孔树脂的氯甲基化度为12.3%。进一步优选，D3520和CCl4的固液比为1:3.5-4.0（g/mL）。进一步优选，D3520、ZnCl2、NaCl和氯甲醚的重量比为1:1.3-1.5:0.40-0.42:0.15-0.17。进一步优选，ZnCl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.12-0.13。由于非极性D3520的高交联度会使其产生严重的空间位阻效应，使改性试剂难以进入D3520内部与之反应，这在很大程度上降低了D3520的改性程度，而柠檬酸铁的特殊存在能够协同超声波作用降低D3520表面扩散层厚度，促进ZnCl2、NaCl、铁粉以及氯甲醚在D3520内部进行扩散，提高氯甲基化试剂和D3520的接触机会，使得反应更为容易进行，此外还有利于提高中间产物的生成速率，使得中间产物快速进入D3520内部，加快中间产物和δ+CH2Cl的相互转换，从而提高D3520的氯甲基化度，进而提高大孔树脂纯化过程中可有效地除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度、改善多糖的感官效果。一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，其具体包括如下步骤：大孔树脂纯化：将抗衰老粗多糖调配成浓度3-5mg/mL的溶液，上样至大孔树脂D3520-CL柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再向浓缩液中加乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，备用，该步骤可以有效能够除去抗衰老多糖中的色素和蛋白质，有效提高多糖的纯度，同时可有效保护多糖的结构和活性；离子交换层析：将大孔树脂纯化后的多糖用去离子水配成浓度18-22mg/mL的溶液，上样至DEAESepharoseCL-6B柱进行离子交换层析纯化，分别用0mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，不同浓度的氯化钠溶液洗脱体积为3-4BV，洗脱的流速设置成0.7-0.8mL/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量，样品直到没有SFPS可以检出就可以，绘制洗脱曲线，分别收集各洗脱峰区间的洗脱液，经大孔树脂纯化后的多糖仍含有一定量的杂质，该步骤用DEAESepharoseCL-6B具有三维空间网状结构，不但具有离子交换作用，而且具有分子筛的作用，其分离多糖相对分子量的范围位于10kDa-4000kDa之间，使得该步骤可根据电荷和分子量的不同达到的双重分离效果，使多糖溶液实现浓缩和初步纯化，具有非常好的分离效能；透析：将离子交换层析后的洗脱液用截留分子量为3000-4000Da透析袋透析至袋外溶液的电导率与去离子水的电导率相同，透析液冷冻干燥，备用，经盐溶液洗脱后的多糖中含有无机盐、低聚糖以及部分色素等杂质，若直接将回收液进行乙醇沉淀，大量的盐分会同时随多糖被沉淀下来，影响后续多糖的纯度和活性研究，因此选择简便有效的透析袋进行多糖的除盐；凝胶色谱柱纯化：将透析得到的多糖粗品配成浓度38-42mg/mL的溶液，分别上样至SephadexG-200凝胶柱进一步纯化，用蒸馏水进行洗脱，通过紫外-可见分光光度计跟踪检验其在480nm处的吸光度，分别以洗脱液的体积和吸光度为横纵坐标绘制洗脱曲线，收集各洗脱峰区域的洗脱液，选择抗老化效果最好的组分，浓缩至小体积，冷冻干燥，即得抗衰老多糖，用离子交换树脂分离各级多糖的依据是其所带电荷量的不同，所以各级分多糖很可能是带电荷量相同的几种多糖的混合物，而凝胶层析的原理是根据待分离物质分子量的大小进行分离的，能够获得高纯度的羊栖菜抗衰老多糖。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术抗衰老多糖的纯化方法简本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，包括大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，其特征在于：所述大孔树脂纯化步骤用大孔树脂为D3520‑Cl。

【技术特征摘要】
1.一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，包括大孔树脂纯化、离子交换层析、透析和凝胶色谱柱纯化，其特征在于：所述大孔树脂纯化步骤用大孔树脂为D3520-Cl。2.根据权利要求1所述的一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，其特征在于：所述D3520-Cl的制备步骤为：将大孔树脂D3520用乙醇溶液溶胀5-6h，随后用乙醇溶液清洗2-4遍后自然风干，然后置于60-70℃的CCl4中溶胀30-40h，再加入ZnCl2、柠檬酸铁、NaCl以及氯甲醚，在温度为45-55℃、超声功率为70-80W的条件下反应16-20h，即得D3520-Cl。3.根据权利要求2所述的一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，其特征在于：所述D3520和CCl4的固液比为1:3.5-4.0（g/mL）。4.根据权利要求2所述的一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，其特征在于：所述D3520、ZnCl2、NaCl和氯甲醚的重量比为1:1.3-1.5:0.40-0.42:0.15-0.17。5.根据权利要求2所述的一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，其特征在于：所述ZnCl2和柠檬酸铁摩尔比为1:0.12-0.13。6.根据权利要求1所述的一种羊栖菜抗衰老多糖的纯化方法，其特征在于：所述大孔树脂纯化步骤为：将抗衰老粗多糖调配成浓度3-5mg/mL的溶液，上样至大孔树脂D3520-Cl柱进行纯化，用去离子水进行洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩至粘稠状态，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢晓丹，
申请(专利权)人：浦江县昂宝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33