一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法技术

本发明专利技术属于生物制品领域，涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。本发明专利技术的制备方法，包括以下步骤：以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备，制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚和层析精纯，最终得到肺炎球菌荚膜多糖，其中，控制粘度的步骤包括：超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。

【技术实现步骤摘要】
一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法
本专利技术属于生物制品领域，涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。
技术介绍
肺炎球菌是革兰氏阳性菌，具有荚膜，为多糖抗原。肺炎球菌可引起多种疾病，如肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等，病情较严重，病死率高，因此，发展预防性疫苗成为一种迫切需求。目前市场上用于预防肺炎球菌感染的有23价肺炎球菌多糖疫苗，10价、13价肺炎球菌多糖结合疫苗，其中23价肺炎球菌多糖疫苗用于成年人，10价、13价用于儿童。多糖疫苗和多糖结合疫苗均需要使用肺炎球菌的荚膜多糖作为原材料进行制备。肺炎球菌的血清型多达90多种，制备方法与标准差异较大，本专利技术涉及的方法能够有效的用于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌多糖的制备。多糖制备的过程分析与控制大多根据多糖浓度、杂质浓度等指标展开。如层析纯化时，对层析样品进行检测，计算多糖和杂质的含量后，根据层析填料的载量得出具体的上样体积。但不同血清型的多糖在相同浓度的情况下粘度差异很大，对于粘度较大的多糖，层析纯化的过程中容易受到粘度的干扰，影响溶液在层析填料中的流动状态，导致杂质去除不充分。对于与膜相关的操作，如超滤、过滤等过程，粘度较大会直接影响大分子的过膜状态，导致多糖分子量不稳定，Kd值指标容易超标。所以粘度也是多糖制备中关键的影响因素。粘度是物质的一种物理化学性质，反应了外力作用下发生变形的流体因抗拒变形而产生的相邻两流体层间的内摩擦力。粘度一般应用于化工和食品行业中，如通过粘度对样品进行条件或者组分的分析。现代医学也有针对于生物样品的相关研究。在生物制品行业，特别是疫苗行业中较少提及，主要因为生物制品的质量控制方法多样，质量标准严苛，理化、生物的方法构成了生物制品行业质量控制的主要手段。但是常用检测手段过程较复杂，检验周期较长。如使用蒽酮硫酸法测定多糖含量，需要用到称量、移液、加热、比色等多步操作，连同前期的准备工作，整个检测过程至少需要2-3个小时。而粘度的检测方法操作简便、快速，锥板式粘度计或旋转式粘度计均可在几分钟内测出样品粘度值，相比于理化检测的滞后性具有明显的优势。由于溶液粘度与多糖浓度正相关，并且粘度体现较为直观，经常作为一种感官指标，仅依靠经验进行判断，没有具体进行检测得出粘度值，所以批间差异较大。结合不同工艺特点，确定不同血清型各步骤的最佳粘度值，能有效的增加产品收获率，提高产品质量。在超滤阶段，浓缩体积的选择是该工艺的关键，在优化流速和TMP的情况下，粘度会影响透过液的流量和透析效果。浓缩体积过小会使透过流速变慢，并且高粘度状态会影响透析液的置换效果；浓缩体积过大会在透析倍数相同的情况下降低效率，同时因体积变大增加下游工艺的压力。超滤阶段控制粘度能够更好的避免过度浓差极化、提高效率、保证效果。在澄清过滤阶段，溶液的粘度会显著影响过滤的效果。粘度大的溶液在过滤时容易造成滤芯过快堵塞，并且会影响多糖的回收率；稀释倍数过大会降低效率，同时因体积变大增加下游工艺的压力。控制合适的粘度能够在保证回收率的情况下更好的达到澄清效果。在CTAB聚合多糖阶段，只对CTAB终浓度进行控制，可能会因为糖浓度的不同使聚合过程不充分。粘度过大的溶液糖浓度较高，可能导致CTAB总量不足，并且影响搅拌效果，使局部反应浓度过高，影响反应的均一性；稀释倍数过大，加大了CTAB的添加量，同时增加了下游工艺的压力。在氯化钠解聚阶段，粘度会影响解聚的效果。控制粘度可以使反应在合理的范围内进行，从而使解聚更充分，提高多糖的回收率。在层析阶段，使用离子交换填料进行多糖的纯化，样品的浓度会影响上样的压力和分离效果，直接控制粘度能够比较直观的优化上样条件。以上提到的关键步骤通过控制粘度指标，均能达到提高多糖质量，增加回收率的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。本专利技术通过快速直观的质量控制手段，确定制备过程中的参数，确保收回率高、质量好的荚膜多糖。由于肺炎血清型的类型较多，工艺差别较大，寻找其中的共性能有效提高生产效率。本专利技术的制备方法，包括以下步骤：以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备，制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚和层析精纯，最终得到肺炎球菌荚膜多糖，其中，控制粘度的步骤包括：超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。具体的，本专利技术的制备方法，包括以下步骤：(a)发酵液的超滤发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后，先进行浓缩，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到目标粘度范围后结束浓缩，开始透析；(b)澄清过滤超滤结束后将溶液进行澄清过滤，过滤前使用相同缓冲液将多糖溶液稀释至目标粘度范围。过滤完成后使用缓冲液冲洗滤芯并收集冲洗液；(c)CTAB聚合多糖添加CTAB前，使用缓冲液稀释多糖溶液至目标粘度范围，持续搅拌添加CTAB溶液；(d)氯化钠解聚过程将步骤(c)中的溶液进行离心，收集CTAB多糖聚合物(部分血清型收集离心上清液，不进行此纯化步骤)，使用氯化钠溶液充分搅拌，搅拌过程通过氯化钠溶液稀释溶液至目标粘度范围；(e)超滤充分解聚的多糖溶液经过离心、澄清过滤后，先进行浓缩，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到目标粘度范围后结束浓缩，开始透析；(f)澄清过滤超滤结束后将溶液进行澄清过滤，过滤前使用相同缓冲液将多糖溶液稀释至目标粘度范围。过滤完成后使用缓冲液冲洗滤芯并收集冲洗液；(g)层析多糖溶液过滤后，使用缓冲液稀释至目标粘度范围，进行上样层析；(h)超滤将层析柱纯化的多糖溶液进行超滤，先进行浓缩，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到目标粘度范围后结束浓缩，开始透析；(i)澄清过滤超滤结束后将溶液进行澄清过滤，过滤前将多糖溶液稀释至目标粘度范围，过滤完成后冲洗滤芯并收集冲洗液；(j)冻干将多糖溶液进行冻干，结束后收集多糖。其中，(a)(e)(h)三处的超滤步骤目标粘度范围是5-10cp；(b)(f)(i)三处的过滤步骤目标粘度范围是5-20cp；(c)的目标粘度范围是1-5cp；(d)的目标粘度范围是1-3cp；(g)的目标粘度范围是10-20cp。本专利技术的发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后，进入超滤步骤。发酵液的初始粘度范围为1-3cp，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到5-10cp后，透过流速有明显的降低现象，此时开始透析。透析完成后为了控制溶液体积需要进行过浓缩，然后通过多次冲洗膜包，收集浓缩液。收集的浓缩液粘度较大，有的高粘度血清型可以达到50cp以上，不利于澄清过滤的进行，需要将溶液粘度稀释至5-20cp，之后进行澄清过滤。过滤之后经过缓冲液冲洗滤器，多糖溶液粘度降低。继续稀释溶液至粘度达到1-5cp。搅拌状态添加CTAB溶液至目标浓度。将CTAB多糖溶液进行离心，对于需要收集沉淀的血清型，将使用氯化钠溶液进行解聚，即将多糖和CTAB的复合物置于氯化钠溶液中搅拌，伴随搅拌过程溶液粘度逐渐增大，通过添加氯化钠溶液的方式控制溶液粘度的范围在1-3cp。将充分解聚的溶液进行离心，收集的上清澄清过滤后进行超滤，同第一步超滤和过滤步骤，当本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备，制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚和层析精纯，最终得到肺炎球菌荚膜多糖，其中，控制粘度的步骤包括：超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。

【技术特征摘要】
1.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备，制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚和层析精纯，最终得到肺炎球菌荚膜多糖，其中，控制粘度的步骤包括：超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)发酵液的超滤发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后，先进行浓缩，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到目标粘度范围后结束浓缩，开始透析；(b)澄清过滤超滤结束后将溶液进行澄清过滤，过滤前使用相同缓冲液将多糖溶液稀释至目标粘度范围。过滤完成后使用缓冲液冲洗滤芯并收集冲洗液；(c)CTAB聚合多糖添加CTAB前，使用缓冲液稀释多糖溶液至目标粘度范围，持续搅拌添加CTAB溶液；(d)氯化钠解聚过程将步骤(c)中的溶液进行离心，收集CTAB多糖聚合物(部分血清型收集离心上清液，不进行此纯化步骤)，使用氯化钠溶液充分搅拌，搅拌过程通过氯化钠溶液稀释溶液至目标粘度范围；(e)超滤充分解聚的多糖溶液经过离心、澄清过滤后，先进行浓缩，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到目标粘度范围后结束浓缩，开始透析；(f)澄清过滤超滤结束后将溶液进行澄清过滤，过滤前使用相同缓冲液将多糖溶液稀释至目标粘度范围。过滤完成后使用缓冲液冲洗滤芯并收集冲洗液；(g)层析多糖溶液过滤后，使用缓冲液稀释至目标粘度范围，进行上样层析；(h)超滤将层析柱纯化的多糖溶液进行超滤，先进行浓缩，随着浓缩过程粘度逐渐增大，达到目标粘度范围后结束浓缩，开始透析；(i)澄清过滤超滤结束后将溶液进行澄清过滤，过滤前将多糖溶液稀释至目标粘度范围，过滤完成后冲洗滤芯并收集冲洗液；(j)冻干将多糖溶液进行冻干，结束后收集多糖。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，(a)要求3中的(a)(e)(h)三处的超滤步骤目标粘度范围是5-10cp；(b)要求3中的(b)(f)(i)三处的过滤步骤目标粘度范围是5-20cp；(c)要求3中的(c)的目标粘度范围是1-5cp；(d)要求3中的(d)的目标粘度范围是1-3cp；(e)要求3中的(g)的目标粘度范围是10-20cp。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后，先进行浓缩，浓缩至粘度达到5-10cp时，开始透析，透析结束后继续将溶液过浓缩，使用缓冲液冲洗膜包，收集浓缩液，搅拌均匀；(2)检测溶液粘度，使用缓冲液稀释溶液粘度至5-20cp进行澄清过滤，过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2-5cp，持续搅拌状态添加CTAB溶液；(3)将CTAB溶液进行离心，收集沉淀，置于氯化钠溶液中持续搅拌，当粘度增加至3-10cp时添加氯化钠溶液至粘度为1-3cp；增加至3-10cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为1-3cp，直至粘度不再上升时解聚过程结束；(4)多糖解聚溶液进行离心、澄清后，进行超滤，同步骤(1)，浓缩至粘度达到5-10cp时，开始透析，透析结束后继续将溶液过浓缩，使用缓冲液冲洗膜包1-4次，收集浓缩液，搅拌均匀，在5-20cp的粘度下进行澄清过滤，过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器，收集冲洗液，再添加缓冲液至溶液粘度10-20cp，(5)将溶液进行层析纯化，收集的层析组分同步骤(a)进行超滤，浓缩至粘度达到5-10cp时，开始透析，透析结束后继续将溶液过浓缩，使用缓冲液冲洗膜包，收集浓缩液，搅拌均匀，在5-20cp的粘度下进行澄清过滤，过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器，收集冲洗液，搅拌均匀后冻干，即得。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后，先进行浓缩，浓缩至粘度达到5-10cp时，开始透析，透析结束后继续将溶液过浓缩，使用缓冲液冲洗膜包2-3次，收集浓缩液，搅拌均匀；(2)检测溶液粘度，使用缓冲液稀释溶液粘度至5-20cp进行澄清过滤，过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2-5cp，持续搅拌状态添加CTAB溶液；(3)将CTAB溶液进行离心，收集沉淀，置于氯化钠溶液中持续搅拌，当粘度增加至3-5cp时添加氯化钠溶液至粘度为2-3cp；增加至3-5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2-3cp，直至粘度不再上升时解聚过程结束；(4)多糖解聚溶液进行离心、澄清后，进行超滤，同步骤(1)，浓缩至粘度达到5-10cp时，开始透析，透析结束后继续将溶液过浓缩，使用缓冲液冲洗膜包2-3次，收集浓缩液，搅拌均匀，在5-20cp的粘度下进行澄清过滤，过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器，收集冲洗液，再添加缓冲液至溶液粘度10-20cp，(5)将溶液进行层析纯化，收集的层析组分同步骤(a)进行超滤，浓缩至粘度达到5-10cp时，开始透析，透析结束后继续将溶液过浓缩，使用缓冲液冲洗膜包2-3次，收集浓缩液，搅拌均匀，在5-20cp的粘度下进行澄清过滤，过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器，收集冲洗液，搅拌均匀后冻干，即得。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，肺炎球菌为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌。7.根据权利要求1所述的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：林彦彬，朱卫华，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，重庆智飞生物制品股份有限公司，安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11