食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用，分子模型主要包括ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY‑ESO‑1自身抗体，可用于制备联合检测区分食管鳞癌患者和健康体检者试剂盒。检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒主要包括重组ALDOAD蛋白、重组ENO1蛋白、重组p53蛋白和重组NY‑ESO‑1蛋白。本发明专利技术首次发现ENO1自身抗体在食管鳞癌患者血清中水平升高，并将ENO1自身抗体与ALDOA自身抗体、p53自身抗体和NY‑ESO‑1自身抗体联合检测用于区分食管鳞状细胞癌患者和健康体检者，比单个指标检测具有更好的区分效果。并且本发明专利技术采用的检测方法为酶联免疫吸附试验间接法，该检测方法简单、易行，具有很好的敏感性和特异性，是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。

【技术实现步骤摘要】
食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用
本专利技术涉及食管鳞状细胞癌领域，尤其涉及联合多个自身抗体，并利用酶联免疫吸附试验间接法，去检测食管鳞癌患者血清标本的水平。
技术介绍
食管癌是一种常见的上消化道恶性肿瘤，在全球范围的各种癌症中，其发病率和死亡率分别排在第八位和第六位。组织病理学检查结果表明，食管癌主要包括食管鳞癌和食管腺癌两种组织病理类型。我国的食管癌病例90％以上是食管鳞癌；食管腺癌主要发生在美国等西方国家。目前食管癌总的5年生存率不足15％，严峻情形十分令人担忧。找寻新的食管癌早期诊断、疗效监测和预后预警的分子标志物，特别是血清分子标志物，帮助食管癌患者能够及时有效的早诊、早治，是提高食管癌患者生存率、降低死亡率的关键科学问题。关于食管鳞癌的特异性血清分子标志物，长期以来临床上一直十分缺乏。目前临床上对所检测的肿瘤血清分子标志物，比如癌胚抗原和鳞状细胞癌抗原等均不是特异性针对食管鳞癌的，利用这些肿瘤血清分子标志物难以对食管鳞癌患者开展准确的评估。按照肿瘤免疫监视理论，正常情况下，人体的免疫监视系统可以及时识别体内癌变的细胞，并进行有效的清除或抑制。肿瘤的自身抗体是机体对肿瘤免疫监视反应的产物，它在肿瘤患者出现临床症状的前几年就可能产生，表明癌症患者肿瘤自身抗体在癌症发生的早期阶段就已经产生。有研究发现，乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等癌症的患者，在不同病期，尤其是早期，均可以检测到血清中肿瘤自身抗体水平升高，这突显出了检测自身抗体作为恶性肿瘤早期诊断分子标志物的潜在应用价值。ALODA是一种糖酵解酶，也是一种催化酶，与糖酵解关系密切。有研究证实ALDOA在多种恶性肿瘤中异常高表达，并且ALDOA的表达与肿瘤的分化、分期及预后相关。ENO1是糖酵解途径中的限速酶之一，在肿瘤代谢方面发挥着重要作用。研究表明，ENO1在多种肿瘤中高表达，广泛参与肿瘤细胞的凋亡、增殖、侵袭以及转移，而且还与肿瘤耐药及肿瘤的免疫治疗密切相关。p53基因是细胞生长的负性调节因子，正常情况下通过调控细胞的增殖和凋亡发挥抑癌作用，p53突变与恶性肿瘤的发生、发展、浸润和转移等生物学行为密切相关。NY-ESO-1是肿瘤睾丸抗原(CTA)亚家族之一，编码基因最早发现于食管癌组织cDNA表达文库中。NY-ESO-1既具有诱导体液免疫应答的能力，也具有激活CD4+和CD8+T淋巴细胞的能力，是到目前为止发现的免疫原性最强的肿瘤特异性抗原。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用。一种检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒，包括重组ALDOAD蛋白、重组ENO1蛋白、重组p53蛋白和重组NY-ESO-1蛋白。本专利技术首次发现ENO1自身抗体在食管鳞癌患者血清中水平升高。相比健康体检者，食管鳞癌患者血清中针对ALODA、ENO1、p53和NY-ESO-1等蛋白的自身抗体水平升高。虽然ALODA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体均具有区分食管鳞癌患者和健康体检者的能力，但因为肿瘤存在异质性，单独检测其中一种自身抗体的诊断效能并不十分理想。因此把4种相关分子联合起来检测食管鳞癌患者则具有更强的判断效能，能把食管鳞癌患者和健康体检者更好地区分开来。其中试剂盒的检测试剂分别是96孔酶标板，碳酸盐缓冲液，牛血清白蛋白，羊抗人IgG-HRP抗体，TMB显色试剂，终止液与PBST溶液。上述检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒在制备联合检测区分食管鳞癌患者和健康体检者试剂盒的应用。其中，所使用的检测方法为酶联免疫吸附试验间接法；所检测的标本为全血分离的血清。检测方法的具体步骤如下：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释重组ALDOA蛋白、重组ENO1蛋白、重人p53蛋白和重组NY-ESO-1蛋白，分别加入到96孔板中，4℃过夜包被；PBST溶液洗涤后，加入含1％BSA的PBST溶液后37℃封闭；PBST溶液洗涤后，加入血清样品，37℃孵育1小时；PBST溶液洗涤后，再加入羊抗人IgG-HRP抗体，37℃孵育1小时；洗涤后，最后加入TMB显色液进行显色，加入终止液终止反应，并在450/630nm双波长下检测各孔吸光度。所述重组ALDOA蛋白检测食管鳞癌患者血清中ALDOA自身抗体，所述重组ENO1蛋白检测食管鳞癌患者血清中ENO1自身抗体，所述重组p53蛋白检测食管鳞癌患者血清中p53自身抗体，所述重组NY-ESO-1蛋白检测食管鳞癌患者血清中NY-ESO-1自身抗体，利用酶标仪在450/630nm双波长下检测ALDOA自身抗体OD值，ENO1自身抗体OD值、p53自身抗体OD值和NY-ESO-1自身抗体OD值；所述ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体水平高低的cut-off值由受试者工作特征曲线(ROC)确定。一种食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型，主要包括ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体。其中，构建分子模型的方程式为：每例标本在应用4种自身抗体分别检测后，其4种自身抗体联合检测的计算公式为P＝1/(1+EXP(α×A+β×B+γ×C+δ×D+ε))，其中α、β、γ、δ、ε为系数，可以通过logistic回归得出，故该公式转换为P＝1/(1+EXP(2.657-4.883*A-3.378*B-8.07*C-3.516*D))；A、B、C、D分别为该例标本中ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体的水平OD值；在计算出每例标本的P值后，再把P值作为检验变量进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，根据ROC得到自身抗体分子标志物模型的cutoff值(0.777)，以及区分食管鳞癌患者和健康体检者的曲线下面积，敏感度和特异度。其中，所述ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体的OD值利用酶标仪在450/630nm双波长下检测。上述食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型在制备联合检测区分食管鳞癌患者和健康体检者试剂盒的应用。可以用于区分食管鳞状细胞癌患者和健康体检者。其中，评价个体食管鳞状细胞癌患者的信息时，只需把ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体的酶联免疫吸附试验结果所对应的OD值代入公式中，就可以得出P值，然后与确定的cut-off值比较。与现有技术相比，本专利技术首次发现ENO1自身抗体在食管鳞癌患者血清中水平升高，并将ENO1自身抗体与ALDOA自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体联合检测用于区分食管鳞状细胞癌患者和健康体检者，比单个指标检测具有更好的区分效果。并且本专利技术采用的检测方法为酶联免疫吸附试验间接法，该检测方法简单、易行，具有很好的敏感性和特异性，是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。附图说明图1是ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体在食管鳞癌患者和健康体检者血清中的水平；图2是ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体区分食管鳞癌和健康体检者的ROC曲线分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒，其特征在于，包括重组ALDOAD蛋白、重组ENO1蛋白、重组p53蛋白和重组NY‑ESO‑1蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒，其特征在于，包括重组ALDOAD蛋白、重组ENO1蛋白、重组p53蛋白和重组NY-ESO-1蛋白。2.根据权利要求1所述检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒，其特征在于，还包括96孔酶标板，碳酸盐缓冲液，牛血清白蛋白，羊抗人IgG-HRP抗体，TMB显色试剂，终止液与PBST溶液。3.根据权利要求1所述检测食管鳞状细胞癌患者的试剂盒在制备联合检测区分食管鳞癌患者和健康体检者试剂盒的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所使用的检测方法为酶联免疫吸附试验间接法；所检测的标本为全血分离的血清。5.一种食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型，其特征在于，主要包括ALDOA自身抗体、ENO1自身抗体、p53自身抗体和NY-ESO-1自身抗体。6.根据权利要求5所述食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型，其特征在于，构建分子模型的方程式为：P＝1/(1+EXP(2.657-4.883*A-3.378*B-8...

【专利技术属性】
技术研发人员：许镒洧，彭裕辉，许丽艳，李恩民，
申请(专利权)人：汕头大学医学院附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：广东,44