NK细胞联合间充质干细胞在治疗肝炎及肝纤维化中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和注射液在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用，该间充质干细胞联合NK细胞及其组合物和注射液可以用于治疗乙型肝炎，并且可以降低肝指数，血清ALT、AST的活性及肝组织中的MDA含量；还具有增高SOD活性的功能，由此得出，本发明专利技术提供的NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和注射液还可以用于治疗肝纤维化。

Application of NK cells combined with mesenchymal stem cells in the treatment of hepatitis and hepatic fibrosis

The present invention provides an application of NK cells combined with mesenchymal stem cells, their compositions and injection in preparing medicines for treating hepatitis and liver fibrosis. The mesenchymal stem cells combined with NK cells and their compositions and injection can be used for treating hepatitis B, and can reduce liver index, the activity of serum ALT and AST, and the content of MDA in liver tissue. The functions of the NK cells combined with mesenchymal stem cells, their compositions and injection can also be used to treat liver fibrosis.

【技术实现步骤摘要】
NK细胞联合间充质干细胞在治疗肝炎及肝纤维化中的应用
本专利技术属于干细胞应用领域，特别涉及一种NK细胞联合间充质干细胞在治疗肝炎及肝纤维化中的应用。
技术介绍
肝脏作为人体内最大、功能最多的实质性腺体器官之一，参与了人体内的许多过程，例如体内消化、代谢、胆汁排泄、解毒和免疫等过程，随着经济的发展，肝脏功能损害相关的疾病发病率呈逐年上升趋势。研究表明，肝脏的病变呈现出多样化和难治愈化趋势。目前，肝病的治疗方法主要有病因治疗、饮食治疗和药物治疗，到目前为止还没有效果十分令人满意的药物。寻求一种安全有效且副作用较小的药物治疗肝脏功能损害成为临床亟待解决的问题，也是成为目前临床研究的热点之一。病毒性肝炎是由几种不同的嗜肝病毒(肝炎病毒)引起的以肝脏炎症和坏死病变为主的一组感染性疾病，其具有传染性较强、传播途径复杂、流行面广泛、发病率高等特点；部分乙型、丙型肝炎等患者可演变成慢性，并可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌，对人民健康危害甚大。目前乙型肝炎患者最为常见。肝纤维化是许多慢性致病因素作用于肝脏引起ECM(extracellularmatrix，细胞外基质)过度沉积的共同病理过程，致病因子引起肝脏氧化应激反应和细胞因子的产生是肝纤维化发生的始动环节。目前用于治疗肝纤维化的药物有核苷类抗病毒药拉夫米、维甲酸等，然而，长期使用上述药物会对肝脏产生毒性。NK细胞(Naturalkillercell，自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。间充质干细胞是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大，横向分化能力，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。目前还没有将NK细胞与间充质干细胞联用用于治疗肝炎及肝纤维化的报道。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种NK细胞联用间充质干细胞、其组合物及其制剂在制备治疗肝炎及肝纤维化药物中的应用。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供一种NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和制剂在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用。进一步的改进，所述NK细胞和间充质干细胞的个数比为5-6:20-30。进一步的改进，所述应用进一步包括将NK细胞和间充质干细胞分别进行培养后混合的步骤。进一步的改进，所述NK细胞的培养具体方法为：将NK细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到(2-3)×107个/mL后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85-90％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞。进一步的改进，所述第一培养基由DMEM培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为2-5μg/mL聚丙烯酸钠、5-10μg/mL亚硒酸钠、5-10μg/mL半胱氨酸、20-25μg/mL甘露醇、1-3μg/mL丝氨酸、3-5μg/mL马齿苋水提物和5-10μg/mL侧伯叶水提物。进一步的改进，所述第二培养基由DMEM培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在DMEM培养液中的总体积分数为7％-12％，所述第二添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为2-5μg/mL谷胱甘肽、15-20μg/mL柠檬酸铁、7-12μg/mL成纤维细胞生长因子、5-10μg/mL生物素、2-5μg/mL氯化硒、3-5μg/mL人白蛋白、1-3μg/mL夏枯草水提取和1-3μg/mL艾叶水提物。进一步的改进，所述第三培养基由DMEM培养液和第三添加剂组成，所述第三添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为1-3μg/mL二乙醇胺、5-10μg/mL月桂酰丝氨酸、1-3μg/mL半胱氨酸、10-15μg/mL山梨醇、5-10μg/mL脯氨酸、1-3μg/mL维生素C、5-10μg/mL野菊花水提取和5-10μg/mL筋骨草水提物。进一步的改进，所述组合物由NK细胞、间充质干细胞和中药提取物组成，所述NK细胞的浓度为5×105-6×105个/mL，所述间充质干细胞的浓度为2×106-3×106个/mL，所述中药提取物的浓度为15-20mg/mL，所述中药提取物是由如下重量份的成分制备而成：仙鹤草5-10密蒙花15-20淡竹叶5-10紫苏子1-3。进一步的改进，所述中药提取物是通过如下方法制备得到的：将仙鹤草、密蒙花、淡竹叶和紫苏子粉碎，用水煎煮2次，第一次用水量为药材总重的5倍，煎煮3h，第二次用水量为药材总重的3倍，煎煮2h，合并煎煮液，过滤，滤液用活性炭脱色，先用石油醚萃取，弃去有机相，水相再用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，水相，浓缩，干燥，得中药提取物。进一步的改进，所述制剂为注射液，所述注射液由间充质干细胞、NK细胞或含有间充质干细胞和NK细胞的组合物、生理盐水及辅料组成，每mL所述生理盐水含有2×106-3×106个间充质干细胞及5×105-6×105个NK细胞和/或15-20mg中药提取物，含有10-20mg辅料，所述辅料由如下重量份的成分组成：甘氨酸5-10葡甲胺2-4甘油1-3聚乙二醇10003-5。本专利技术提供一种NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和注射液在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用，该间充质干细胞联合NK细胞及其组合物和注射液可以用于治疗乙型肝炎，并且可以降低肝指数，血清ALT、AST的活性及肝组织中的MDA含量；还具有增高SOD活性的功能，由此得出，本专利技术提供的NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和注射液还可以用于治疗肝纤维化。具体实施方式实施例1一种NK细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中NK细胞和间充质干细胞的个数比为1:4。实施例2一种NK细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中NK细胞和间充质干细胞的个数比为1:5。实施例3一种NK细胞和间充质干细胞的混合细胞，其中NK细胞和间充质干细胞的个数比为1:6；所述NK细胞和间充质干细胞均是分别培养后再进行混合；所述NK细胞的培养具体方法为：将NK细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到3×107个/mL后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述第一培养基由DMEM培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为2μg/mL聚丙烯酸钠、5μg/mL亚硒酸钠、5μg/mL半胱氨酸、20μg/mL甘露醇、1μg/mL丝氨酸、3μg/mL马齿苋水提物和5μg/mL侧伯叶水提物；所述第二培养基由DMEM培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在DMEM培养液中的总体积分数为7％，所述第二添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为2μg/mL谷胱甘肽、15μg/mL柠檬酸铁、7μg/mL成纤维细胞生长因子、5μg/mL生物素、2μg/mL氯化硒、3μg/mL人白蛋白、1μg/mL夏枯草水提取和1μg/mL艾叶水提物；所述第三培养基由DMEM培养液和第三添加剂组成，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和制剂在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞联合间充质干细胞、及其组合物和制剂在制备治疗肝炎及肝纤维化的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NK细胞和间充质干细胞的个数比为5-6:20-30。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用进一步包括将NK细胞和间充质干细胞分别进行培养后混合的步骤。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述NK细胞的培养具体方法为：将NK细胞在第一培养基中培养，当培养的细胞密度达到(2-3)×107个/mL后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养具体方法为：将间充质干细胞在第三培养基中培养，当培养的细胞汇合达到85-90％后，加入第二培养基进行传代培养，收集第四代间充质干细胞。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一培养基由DMEM培养液和第一添加剂组成，所述第一添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为2-5μg/mL聚丙烯酸钠、5-10μg/mL亚硒酸钠、5-10μg/mL半胱氨酸、20-25μg/mL甘露醇、1-3μg/mL丝氨酸、3-5μg/mL马齿苋水提物和5-10μg/mL侧伯叶水提物。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二培养基由DMEM培养液、胎牛血清和第二添加剂组成，所述胎牛血清在DMEM培养液中的总体积分数为7％-12％，所述第二添加剂各成分及其在DMEM培养液中的浓度为2-5μg/mL谷胱甘肽、15-20μg/mL柠檬酸铁、7-12μg/mL成纤维细胞生长因子、5-10μg/mL生物素、2-5μg/mL氯化硒、3-5μg/mL人白蛋白、1-3μg/mL夏枯草水提取和1-3μg/mL艾叶水提物。7.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘世红，董明珠，潘新，卢承前，
申请(专利权)人：北京世纪劲得生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11