一种外泌体水凝胶及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种外泌体水凝胶及其制备与应用，所述外泌体水凝胶是由骨髓间充质干细胞来源的外泌体与海藻酸钠、二水氯化钙、PBS缓冲液组成凝胶体系，混合获得的。本发明专利技术提供了一种具有更好疗效的外泌体水凝胶，能够增强外泌体的在心脏内的驻留时间，通过对心梗28天后大鼠心功能进行分析可以看到外泌体结合水凝胶相比于单纯应用外泌体有着更好的效果，同时通过对血管新生染色可以看到应用该组合物后有更多的新生血管。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体水凝胶及其制备与应用(一)
本专利技术涉及一种外泌体水凝胶及其制备与应用。(二)
技术介绍
外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm。外泌体中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能够作为信号分子传递给其它细胞从而改变其它细胞的功能，在免疫抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复中有重要作用。骨髓间充质干细胞是一种具有高度自我更新能力与多向分化潜能的多能干细胞，现有研究表明骨髓间充质干细胞来源的外泌体在减少心肌损伤范围、减少心肌梗死后心脏重构、改善心功能方面有重要的作用，同时已有文献表明干细胞来源的外泌体治疗比单纯的干细胞移植更加安全有效。海藻酸钠是一种从褐藻中提取的天然线性多糖，由1-4键合的β-D-甘露糖醛酸(M单位)和α-L-古洛糖醛酸(G单位)残基组成。由于海藻酸钠的生物相容性、低毒性已经被广泛地研究应用于药物释放体系和组织工程领域。已有文献表明，海藻酸钠水凝胶作为细胞因子等缓控体系已经广泛应用于各个领域。然而，单纯心肌内注射外泌体治疗急性心肌梗死面临着降解快、利用率低等问题，但是通过结合海藻酸钠水凝胶可以延缓其驻留时间进而发挥更好的治疗效果。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种骨髓间充质干细胞来源的外泌体结合海藻酸钠的水凝胶，以及通过其缓控释作用来治疗急性心肌梗死。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种外泌体水凝胶，所述外泌体水凝胶是由骨髓间充质干细胞来源的外泌体与海藻酸钠、二水氯化钙、PBS缓冲液组成凝胶体系，混合获得的。进一步，所述凝胶体系中外泌体终浓度为0.6-1μg/μl，海藻酸钠终浓度1.2％-2％，二水氯化钙终浓度0.1％-0.4％，溶剂为PBS缓冲液(pH7.4)，更优选凝胶体系中外泌体终浓度为0.8μg/μl，海藻酸钠终浓度1.6％，二水氯化钙终浓度0.2％，溶剂为PBS缓冲液(pH7.4)。优选海藻酸钠以质量浓度1.5-2.5％海藻酸钠PBS溶液的形式加入，二水氯化钙以质量浓度0.5-2％二水氯化钙PBS溶液的形式加入。进一步，所述外泌体水凝胶按如下方法制备得到：将骨髓间充质干细胞来源的外泌体加入质量浓度1.5-2.5％海藻酸钠PBS溶液中，按照海藻酸钠PBS溶液：二水氯化钙PBS溶液体积比4:1再加入质量浓度0.5-2％二水氯化钙PBS溶液组成凝胶体系，在37℃混合均匀，制得所述外泌体水凝胶；所述凝胶体系中外泌体终浓度为0.6-1μg/μl，海藻酸钠质量终浓度1.2％-2％，二水氯化钙质量终浓度0.1％-0.4％。本专利技术所述骨髓间充质干细胞来源的外泌体的获得为常规方法，优选超速离心法。本专利技术还提供一种所述外泌体水凝胶在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提供了一种具有更好疗效的外泌体水凝胶，能够增强外泌体在心脏内的驻留时间，通过对心梗28天后大鼠心功能进行分析可以看到外泌体结合水凝胶相比于单纯应用外泌体有着更好的效果，同时通过对血管新生染色可以看到应用该组合物后有更多的新生血管。(四)附图说明图1为实施例1中各组大鼠造模前、造模后、28天，心超EF(A)、FS(B)及梗死区厚度(C)。图2为实施例2外泌体经水凝胶包裹及单纯外泌体在心肌内注射3天后在各个重要脏器荧光度，A为离体心脏荧光图，B为荧光统计，C为离体肝脾肺肾荧光图。图3为各组大鼠28天心脏梗死周边区血管新生情况，A为CD31及α-SMA染色，B为CD31染色统计结果，C为α-SMA染色统计结果。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术实施例所述PBS缓冲液pH为7.4。实施例1：外泌体水凝胶对心肌梗死大鼠心功能的改善情况1、试剂及材料：雄性4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(180-200g)SPF级(浙江中医药研究院动物实验中心)、低糖DMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、戊巴比妥(Merck)、海藻酸钠(阿拉丁公司)、二水氯化钙(Sigma公司)、PBS缓冲液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)、Bradford蛋白定量试剂盒(碧云天公司)、小动物超声仪(Vevo2100ImagingSystem，VisualsonicsInc)。2、实验步骤：(1)骨髓间充质干细胞来源的外泌体的获取处死雄性4周龄SD大鼠，取其骨髓间充质干细胞，进行传代培养，取第三代的骨髓间充质干细胞，接种于含体积浓度10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2条件下培养至90％密度，再换成低糖DMEM培养基，48h后收集上清。将所得上清500g离心10min弃沉淀取上清，再2000g离心20min弃沉淀取上清，再10000g离心30min弃沉淀取上清，将所得上清进一步浓缩10倍体积后120000g超速离心70min，弃上清取沉淀，将沉淀用PBS缓冲液重悬后再120000g离心70min，取沉淀，即为外泌体。将所得外泌体应用Bradford法进行蛋白定量。(2)外泌体水凝胶的制备将海藻酸钠粉末溶于PBS缓冲液配成质量浓度2％海藻酸钠溶液，将80μg步骤(1)制备的外泌体均匀混悬于80μL2％海藻酸钠溶液中，再加入20μL质量浓度1％二水氯化钙PBS溶液组成凝胶体系，在37℃中静置反应10min，获得外泌体终浓度为0.8μg/μL的外泌体水凝胶，海藻酸钠质量终浓度1.6％、二水氯化钙质量终浓度0.2％。同样条件下，不添加外泌体，制备得到海藻酸钠水凝胶。(3)动物实验功能学研究1)麻醉：按40mg/kg计算，用1％无巴比妥钠腹腔麻醉。2)分组：SD大鼠急性心肌梗模型的构建：先经口腔气管内插入鞘管，接小型动物呼吸机。第3、4肋间胸骨左侧纵向切开进胸，钝性撕开心包膜，在左心耳下缘1～2mm水平，采用眼科无创缝合针结扎左冠状动脉左前降支，肉眼观察到结扎区变白，获得心梗模型。造模后随机抽取40只，分成4组，每组10只，分别为组1(PBS组，MI)、组2(海藻酸钠水凝胶组，Gel)、组3(外泌体组，Exo)、组4(外泌体水凝胶组，Exo+Gel)。3)处理方式：造模成功后，组1心肌内注射100μlPBS缓冲液，组2心肌内注射100μl海藻酸钠水凝胶，组3心肌内注射100μl终浓度0.8μg/μl外泌体的PBS溶液，组4心肌内注射100μl步骤(2)制备的外泌体水凝胶。4)指标测定：对每只大鼠造模前、造模后及注射28天进行心脏超声测定心脏功能学分析，EF(图1中A)、FS(图1中B)及梗死区厚度(图1中C)。5)统计学方法：数据均用均数±方差表示；多组间比较采用单因素方差分析，p<0.05具有统计学差异。结果：从28天心超结果来看，外泌体水凝胶组比单纯应用外泌体或者海藻酸钠水凝胶有更好的EF和FS，而且梗死区厚度相比其他各组更厚。实施例2：外泌体水凝胶移植后在心肌梗死区的驻留情况1、试剂及材料：Dir细胞膜染料(ThermoInvitrogen)，小动物活体示踪仪(PerkinElmer)，其它同实施例1。2、实验步骤(1)外泌体的提取，动物心梗模型的建立，同实施例1。(2)将所得外泌体用DIR膜性染料进行染色，使外泌体标记上荧光染料本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体水凝胶，其特征在于所述外泌体水凝胶是由骨髓间充质干细胞来源的外泌体与海藻酸钠、二水氯化钙、PBS缓冲液组成凝胶体系，混合获得的。

【技术特征摘要】
1.一种外泌体水凝胶，其特征在于所述外泌体水凝胶是由骨髓间充质干细胞来源的外泌体与海藻酸钠、二水氯化钙、PBS缓冲液组成凝胶体系，混合获得的。2.如权利要求1所述外泌体水凝胶，其特征在于所述凝胶体系中外泌体终浓度为0.6-1μg/μl，海藻酸钠质量终浓度1.2％-2％，二水氯化钙质量终浓度0.1％-0.4％，溶剂为PBS缓冲液。3.如权利要求1所述外泌体水凝胶，其特征在于所述凝胶体系中外泌体终浓度为0.8μg/μl，海藻酸钠质量终浓度1.6％，二水氯化钙质量终浓度0.2％，溶剂为PBS缓冲液。4.如权利要求1所述外泌体水凝胶，其特征在于所述海藻酸钠以质...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡新央，王建安，吕凯琪，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33