最终消毒的来自细胞外基质的水凝胶的制备方法技术

这里提供了用于制备消毒的、凝胶化的、溶液化的细胞外基质(ECM)组合物的方法，这种组合物可以有效用作细胞生长底物。这里还提供了使用本发明专利技术方法制备的组合物及其应用。在一个实施方案中，提供了一种装置，例如，假肢。所述装置包括一种无机基质，在此无机基质中分散着经过消毒、凝胶化、溶液化的ECM，从而促进细胞生长进入细胞外基质中并因此使病人适应该装置和/或将该装置附着到病人身上。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年3月21日递交的美国临时专利申请第61/968,716号的优先权，该申请通过引证在此全部并入本文。.
技术介绍
这里描述了一种对ECM衍生的水凝胶进行消毒的方法。细胞外基质-(ECM-)脚手架的最终消毒(例如，通过与环氧乙烷(EtO)气体相接触、暴露在γ射线照射中或者电子束辐射中)能够抑制细胞外基质-(ECM-)衍生的水凝胶的形成。临床前的研究结果已经显示并且持续表明细胞外基质-(ECM-)降解产物的显著效果，而细胞外基质-(ECM-)水凝胶中富集这种细胞外基质-(ECM-)降解产物。在临床转化并广泛的商业应用水凝胶产品之前，必须首选确定细胞外基质-(ECM-)水凝胶的消毒方法。
技术实现思路
这里描述了制备细胞外基质-(ECM-)凝胶剂及其相关组合物的方法。用一种酸性蛋白质消化最终消毒的细胞外基质-(ECM-)材料产生消化液，然后中和并将所得溶液温度升高到37℃时通常不会产生细胞外基质-(ECM-)水凝胶。而这里所描述的是一些溶液会遇到这种问题，即在最终消毒之后，仍然会产生可再生的凝胶化作用。通过环氧乙烷、电子束和γ射线对多剂量的实心板形式的细胞外基质-(ECM-)脚手架进行消毒不会形成水凝胶。但是，我们在这里显示，在消毒之前，所述材料从板型变成冷冻干燥的细胞外基质-(ECM-)消化液会导致水凝胶的形成。如下面实施例所示，举例并不做任何限制，冷冻干燥(冻干)细胞外基质-(ECM-)消化物，通过与环氧乙烷气体接触对干燥的消化物消毒，并在水中重新组成干燥的预-凝胶，产生另一种消化物，这种消化物经过中和并在37℃下培养克再生的成胶。根据这些结果，可以预计使用其他可接受的方法(例如电子束辐射、γ射线、X射线、超临界二氧化碳方法)对干燥的消化物进行最终消毒同样可以形成细胞外基质-(ECM-)水凝胶。这里提供了用于制备消毒的、凝胶化的、溶液化的细胞外基质-(ECM-)组合物的方法，这种组合物可以有效用作细胞生长脚手架。在移植到病人中或者对病人施用之前，所述组合物处于非凝胶化形式，在凝胶化之前铸模并在此处原位成胶。这里还提供了使用本专利技术方法制备的组合物及其应用。在一个实施方案中，提供了一种装置，例如，假肢。所述装置包括一种无机基质，在此无机基质中分散着经过消毒、凝胶化、溶液化的ECM，从而促进细胞生长入细胞外基质中并因此使病人适应该装置和/或将该装置附着到病人身上。附图说明图1是示意图，显示了这里所描述的股骨移植物的实施方案。图2是示意图，显示了这里所描述的义肢手的实施方案。图3是膀胱壁横截面示意图(未按比例描绘)。显示了下列结构：上皮细胞层(A)、基膜(B)、固有膜(C)、粘膜肌层(D)、粘膜下层(E)、外肌膜(F)、浆膜层(G)、粘膜(H)和膀胱管(L)。图4A是冷冻干燥的猪膀胱基质(UBM)层的照片。图4B是冷冻干燥的猪膀胱基质(UBM)粉末的照片。图4c是浓度为10毫克/毫升的膀胱基质(UBM)胃蛋白酶消化液照片。图4D是4毫克/毫升膀胱基质(UBM)和8毫克/毫升膀胱基质(UBM)的照片，其中，显示4毫克/毫升的胶原蛋白I(ColI)水凝胶做对比(D)。图5显示了膀胱基质(UBM)和胶原蛋白I水凝胶的凝胶电泳结果。图6A是3毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。图6B是3毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在10,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。图6C是6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。图6D是6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在10,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。图7A是4毫克/毫升胶原蛋白I凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)图7B是4毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)图8A显示了比浊法测定的胶原蛋白I和膀胱基质(UBM)水凝胶的凝胶化动力学，通过在凝胶化期间使用分光光度计测定吸光度来确定。结果显示为测量的吸光度值。图8B显示了比浊法测定的胶原蛋白I和膀胱基质(UBM)水凝胶的凝胶化动力学，通过在凝胶化期间使用分光光度计测定吸光度来确定。结果显示为规范化的吸光度值，这可以用于计算动力学参数，例如t1/2(达到50％最大浊度的时间)、tlag(凝胶化的滞后时间)和S(凝胶化速度)。图9显示了比浊法测定的1毫克/毫升小肠粘膜下层(SIS)凝胶的凝胶化动力学。图10显示了膀胱基质(UBM)凝胶在凝胶化期间的流变学测量值，其中，通过以固定的频率监控凝胶化期间样品振动模量，以机械方式确定凝胶化作用。结果显示了3毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶和6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶的弹性模量(G′)和粘滞模量(G″)。图11A显示了LS(肝基质细胞)和小肠粘膜下层(SIS)凝胶在凝胶化期间的流变性测量值。在5％菌株和1rad/sec下测定凝胶化动力学。结果显示了LS、SIS和UBM水凝胶在6毫克/毫升下的弹性模量(G′)。图11B显示了LS(肝基质细胞)和小肠粘膜下层(SIS)凝胶在凝胶化期间的流变性测量值。在5％菌株和1rad/sec下测定凝胶化动力学。结果显示LS、SIS和UBM水凝胶在6毫克/毫升下的储能模量(G′)作为角频率的函数。图12显示了3毫克/毫升胶原蛋白I凝胶和3毫克/毫升和6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶的频率对动态粘度的作用。图13A显示了深入于膀胱基质(UBM)凝胶中的多孔肽纤维照片，其中，所述纤维不使用超声破碎处理。条形图度量是2000微米。图13B显示了深入于膀胱基质(UBM)凝胶中的多孔肽纤维照片，其中，所述纤维使用超声破碎处理。条形图度量是2000微米。图14A显示了在纤维孔中包含Ti6Al4V线的多孔金属脚手架的SEM图像。图14B显示了杂合细胞外基质-(ECM-)/多孔金属脚手架的电子扫描显微镜图片，其中，膀胱基质(UBM)凝胶包覆Ti6Al4V线。图14C显示了包含烧结的商品纯钛(CPTi)小珠的多孔金属脚手架的SEM图像。图14D显示了进行超声破碎之后杂合细胞外基质-(ECM-)/多孔金属脚手架和CPTi小珠的ESEM图像。图15显示了最终消毒后水凝胶形成的定性观察。与未消毒的参照相比，在除去金属环霉菌(上图)之后，随着最终消毒皮肤细胞外基质-(ECM-)形成水凝胶的能力被消除。图16A显示未消毒的冷冻干燥的预-凝胶。图16B显示未消毒的冷冻干燥的在HCl中重组的预-凝胶。图16C显示未消毒的冷冻干燥的在去离子水中重组的预-凝胶。图16D显示了用环氧乙烷消毒的冷冻干燥的预-凝胶和在水中或者HCl中重组的预凝胶。图16B和图16C的比较显示，除了在HCl中消毒的样品(图16D)之外，其它所有样品的重组是完整的。图17显示冷冻干燥的SIS-ECM预-凝胶的消毒导致水凝胶形成。图18显示冷冻干燥的膀胱基质(UBM)预凝胶的消毒导致水凝胶形成。图19A脱细胞的膀胱基质(UBM)各种消毒方法的比较。图19B是图19A的定性比较。具体实施方式本申请中在指定各种范围时所使用的数值，除非另有明确说明，仅仅是约数，比如所述范围内的最小值和最大值之前本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备细胞外基质衍生的凝胶的方法，包括：(i)通过使用在酸性溶液中的酸性蛋白酶消化溶解未经透析的细胞外基质(ECM)，产生消化液，(ii)干燥所述消化液，和(iii)对干燥的消化物消毒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.21 US 61/968,7161.一种制备细胞外基质衍生的凝胶的方法，包括：(i)通过使用在酸性溶液中的酸性蛋白酶消化溶解未经透析的细胞外基质(ECM)，产生消化液，(ii)干燥所述消化液，和(iii)对干燥的消化物消毒。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括(iv)水合消毒的干燥消化物，产生消毒的消化液，(v)将所述消化液的pH值提高到7.2-7.8之间，产生中和的消化液，和(vi)在温度大于25℃时使所述溶液成胶。3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括(iv)水合并中和所述消毒的干燥消化物，使其pH值提高到7.2-7.8之间，产生中和的消化液，和(vi)在温度大于25℃时使所述溶液成胶。4.根据权利要求1-3中任意一个所述的方法，其中，所述细胞外基质(ECM)在溶解步骤之前不是最终消毒的、透析的或者经过交联加工。5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述干燥的消化液是冷冻干燥的。6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中使用γ射线、电子束辐射、环氧乙烷和/或超临界的二氧化碳对消化液进行消毒。7.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)来源于哺乳动物组织。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物组织来源于膀胱、脾、肝、心脏、中枢神经系统、脂肪组织、骨骼、胰腺、卵巢，或者肠的其中之一。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物组织来源于猪、母牛、猴子，或者人。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物组织来源于肠。11.根据权利要求10所述的方法，其中哺乳动物组织来源于大肠或者结肠。12.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)包括上皮细胞的基膜和猪膀胱的固有膜。13.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)是粉碎的。14.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，在凝胶化之前，所有溶液被维持在25℃或者低于25℃。15.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞外基质(ECM)在pH为2或者更高的情况下溶解。17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞外基质(ECM)在pH在3到4之间时溶解。18.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述酸性溶液包括0.01MHCl。19.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述酸性蛋白酶是胰蛋白酶。20.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，向消化液中加入碱或者等渗溶液来增加消化液的pH值。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述碱或者等渗溶液是NaOH或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。22.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述消化液在pH为7.4的情况下成胶。23.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述消化液在30℃或者更高的温度下成胶。24.根据权利要求23中任意一项所述的方法，其中所述消化液在37℃下成胶。25.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，进一步包括向病患给药所述中和的消化液，并且其中，成胶作用发生在病人体内或者病人身上。26.根据权利要求25所述的方法，其中，在对病患给药期间，通过将消化液与碱或者缓冲液相混合升高消化液的pH值。27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述病患是人。28.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，进一步包括向凝胶中整合一个或多个细胞、药物、细胞因子和生长因子。29.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中一个或者多个细胞、药物、细胞因子和生长因子被...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·F·巴迪拉克，C·L·德思，提摩太·J·小基恩，N·J·特纳，
申请(专利权)人：匹兹堡大学联邦高等教育体系，
类型：发明
国别省市：美国;US