一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶及其制备的支架及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶，其通过使用HRP和H

【技术实现步骤摘要】
一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶及其制备的支架及应用
本专利技术涉及组织工程材料领域，更特别的，涉及一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶及其制备的支架及应用。
技术介绍
水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，具有网状交联结构的水溶性高分子中存在疏水基团和亲水基团，亲水基团与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水基团遇水膨胀的交联聚合物。丝胶蛋白(SilkSericin)是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20-30％，由分子量为24-400kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。近年来，由于丝胶蛋白良好的生物相容性、对细胞具有粘附和保护作用等生物学性能，成为生物医学领域新兴的材料。蛋白质的交联主要分为两类方法，化学交联和酶交联。常用的化学交联剂有戊二醛和京尼平。常用于蛋白质交联的酶有转谷氨酰胺酶(TG)和多酚氧化酶(PPO)。目前，主要使用化学交联剂戊二醛和天然生物交联剂京尼平将丝胶蛋白交联成水凝胶支架，未见使用酶催化交联的方法来制备水凝胶支架。在中国，癌症已成为疾病死因之首，发病率和死亡率在持续上升，癌症已成为非常重要的公共健康问题。2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例。研究肿瘤细胞的生长增殖、侵袭、转移和耐药，是找到肿瘤治疗靶点和药物的重要手段。传统的针对肿瘤致病机制和肿瘤治疗的研究所采用的二维(2D)研究模型是基于二维平面，难以模拟体内真实肿瘤的立体结构和内部环境。如果能建立体外三维(3D)肿瘤模型，并用于研究肿瘤细胞行为和对外界刺激及药物的响应，则能更精确地反映真实体内肿瘤的情况。然而，目前没有一种能够构建体外3D肿瘤模型，并且适用于对这样的肿瘤模型进行观察、示踪和研究的支载材料。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶，其通过使用HRP和H2O2催化丝胶蛋白交联得到所述丝胶蛋白水凝胶制备得到。优选地，所述所述HRP的工作浓度为0.625-25U/mL，所述H2O2的工作浓度为0.00075％-0.03％，所述丝胶蛋白的浓度为2.5-40mg/mL。优选地，所述丝胶蛋白水凝胶通过包括以下步骤的方法得到：1)使用不含家蚕丝素的蚕丝制备成丝胶蛋白水溶液；2)向所述丝胶蛋白水溶液中添加浓度为的H2O2和HRP，得到预成胶液；3)将所述预成胶液于37℃成胶，得到所述丝胶蛋白水凝胶。优选地，所述蚕丝为由家蚕丝素缺失型蚕所生产的蚕丝。本专利技术还提供了上述丝胶蛋白水凝胶在医药材料中的应用。本专利技术还提供了由上述丝胶蛋白水凝胶冷冻干燥得到的一种支架。本专利技术还提供了上述支架在体外构建三维肿瘤模型中的作用。本专利技术还提供了上述支架在体外构建细胞培养模型中的作用。本专利技术还提供了上述支架在研究肿瘤耐药性中的作用。本专利技术还提供了上述支架在新药筛选中的作用。本专利技术的丝胶蛋白水凝胶以及由其制备的支架，是一种全新的生物复合材料，不同于其他交联剂形成的丝胶蛋白水凝胶，本专利技术采用全新的交联剂和交联方式形成的丝胶蛋白水凝胶为无色透明。基于此优良特性其可用于以下用途：1.建立3D肿瘤模型，更真实而贴切地模拟体内真实肿瘤的结构，应用于肿瘤致病机制和肿瘤治疗的研究；2.作为细胞培养模型，其无色透明的特性能应用于细胞的直接观察和示踪；3.作为肿瘤耐药模型，更好地模拟肿瘤耐药；4.作为药物和新合成化合物的筛选和研究平台，其无色透明特性能够更好地直接示踪相应的药物、新合成化合物。本专利技术的丝胶蛋白水凝胶及其所制备的支架能够更好地模拟体内真实肿瘤的立体结构和肿瘤微环境，为肿瘤致病机制、肿瘤耐药、肿瘤治疗的研究提供更贴近真实肿瘤情况的研究模型，此外还能够用于3D细胞培养，也能够应用于药物和新合成化合物的筛选和示踪。附图说明图1为丝胶浓度对丝胶蛋白水凝胶成胶时间影响的示意图；图2为HRP浓度对丝胶蛋白水凝胶成胶时间影响的示意图；图3为H2O2浓度对丝胶蛋白水凝胶成胶时间影响的示意图；图4为丝胶蛋白水凝胶支架不同pH条件下的吸水膨胀率；图5为不同pH条件下丝胶蛋白水凝胶支架的降解情况示意图；图6为不同温度冻干的丝胶蛋白水凝胶支架的扫描电镜微观结构示意图；图7为不同温度冻干的丝胶蛋白水凝胶支架的孔径统计柱状图；图8为不同交联剂制备的丝胶蛋白水凝胶的外观示意图；图9为丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的红外光谱分析结果；图10为丝胶蛋白和丝胶蛋白水凝胶的荧光光谱；图11为丝胶蛋白水凝胶搭载细胞的光镜照片；图12为丝胶蛋白水凝胶的粘附细胞数目统计柱状图；图13为丝胶蛋白水凝胶上搭载的细胞活力统计柱状图；图14为鬼笔环肽对丝胶蛋白水凝胶搭载细胞上的β-actin进行染色的免疫荧光照片；图15为丝胶蛋白水凝胶搭载的细胞体面积的柱状统计图；图16为丝胶蛋白水凝胶搭载的细胞体周长的柱状统计图；图17为丝胶蛋白水凝胶支架上种植细胞的共聚焦显微镜拍照示意图；图18搭载HT-29细胞的3D丝胶蛋白水凝胶支架超微结构的电镜照片、HE染色照片和结直肠癌组织的HE染色照片；图19为搭载HT-29细胞的3D丝胶蛋白水凝胶支架培养的第1天、第5天、第10天的光镜照片和HE染色照片；图20为3D肿瘤模型的立体结构示意图；图21为搭载HT-29细胞的3D丝胶蛋白水凝胶支架和结直肠癌组织的示意图；图22为2D平面培养的细胞和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养的细胞在裸鼠皮下成瘤实验的示意；。图23为2D平面和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养HT-29细胞对5-氟尿嘧啶耐药情况示意图；图24为2D平面和3D丝胶蛋白水凝胶支架培养HT-29细胞对塞来昔布耐药情况的示意图。具体实施方式以下结合实例和附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。丝胶蛋白水凝胶和水凝胶支架的制备本专利技术的丝胶蛋白水凝胶和水凝胶支架通过以下方法来制备：1.制备丝胶水溶液蚕丝来自家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所)。通过以下方法从该蚕茧制备丝胶水溶液：1)称取家蚕突变品种蚕茧1g并剪成1cm2的碎片，后置于洁净的烧杯中，用超纯水清洗3次，3500rpm离心5分钟去除水份；2)向步骤1)中得到的蚕茧碎片中加入55mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液，将该烧杯放入恒温水浴锅内35℃水浴24小时，溶解丝胶蛋白；3)将步骤2)得到溶液转入离心管内3500rpm离心5分钟，用滤器去除不溶性物质，得到澄清的溶液；4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入1/4体积的Tris-HCl缓冲液(1mol/L，pH9.0)；5)将步骤4)中的溶液转入到预处理好的透析袋(MWCO3500)中，然后将透析袋两端用夹子夹紧，放置于含有pH9.0的0.001mol/LTris-HCl缓冲液的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析48小时，其中最后一次使用超纯水透析；6)将5)中透析后的丝胶蛋白水溶液转到离心管中，4000rpm离心5分钟，去除沉淀；7)将丝胶蛋白水溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧，再将透析袋置于质量百分浓度为20％的PEG6000溶液中浓缩；将丝胶蛋白水溶液浓缩到浓度约为2％为止；8)置于4℃冰箱保存备用。2.制备H2O2工作液：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶，其特征在于，通过使用HRP和H

【技术特征摘要】
1.一种无色透明的丝胶蛋白水凝胶，其特征在于，通过使用HRP和H2O2催化丝胶蛋白交联得到所述丝胶蛋白水凝胶制备得到。2.根据权利要求1所述的丝胶蛋白水凝胶，其特征在于，所述HRP的工作浓度为0.625-25U/mL，所述H2O2的工作浓度为0.00075％-0.03％，所述丝胶蛋白的浓度为2.5-40mg/mL。3.根据权利要求1或2所述的丝胶蛋白水凝胶，其特征在于，通过包括以下步骤的方法制备得到：1)使用不含家蚕丝素的蚕丝制备成丝胶蛋白水溶液；2)向所述丝胶蛋白水溶液中添加浓度为的H2O2和HRP，得到预...

【专利技术属性】
技术研发人员：王征，王琳，王健，李晓麟，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42