一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，涉及生物干细胞技术领域，本发明专利技术方法能够制备凝胶，该凝胶可以作用于组织外伤，起到止血、修复破损表皮伤口的作用，同时还能改善皮肤老化问题，恢复皮肤的生理机能。

Preparation method of gel with trauma repair and anti-aging function

The invention provides a preparation method of gel with trauma repair and anti-aging function, and relates to the field of biological stem cell technology. The method can prepare gel, which can act on tissue trauma, stop bleeding and repair damaged skin wounds, and improve skin aging problem and restore physiological function of skin.

【技术实现步骤摘要】
一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法
本专利技术涉及生物干细胞
，尤其涉及一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层，具有多向分化潜能、免疫调节作用、旁分泌作用且免疫原性低，不会引起排斥反应等功能，因此受到人们的广泛关注，具有广阔的前景。本专利技术利用的就是脐带间充质干细胞的旁分泌作用。脐带间充质干细胞在培养过程中会分泌多种细胞生长因子，包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)等。这些细胞因子具有调节机体免疫、促进细胞增殖、促进血管再生等功能，对受损皮肤、敏感皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，能淡化色斑、恢复皮肤的光滑与弹性、减少皱纹、改善皮肤老化问题，促进伤口快速愈合，避免形成疤痕等，但是如何能够制备相关药剂，使其能够显著提高皮肤伤口的愈合速度，并且改善皮肤老化问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，该凝胶能够显著提高皮肤伤口的愈合速度，还可以改善皮肤老化问题。本专利技术是通过以下技术方案予以实现：一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定：a.脐带取样以及检测：取健康足月新生儿脐带8-12cm，置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测；b.脐带清洗：用浸润有75％酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒，然后在生物安全柜内打开瓶盖，用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75％酒精浸润2-4秒后迅速取出，并转移到一个新的200ml无菌杯中，然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次；c.脐带处理：将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中，用止血钳挤压血管排空血管中的血液，用生理盐水继续清洗干净；用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中，用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块；d.脐带间充质干细胞培养：使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中，每瓶150-300块，然后将培养瓶竖起，沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基；拧上瓶盖，翻转培养瓶，使接种组织块的瓶壁在上，放置于37℃，5％CO2的培养箱中静置贴壁4h以上；之后翻转培养瓶，让培养基完全浸润每一块组织块，置于培养箱中培养；前七天保持培养瓶静止，第七天半量换液，第十二天观察到较多纤维状细胞爬出，此时工作人员去除组织块，半量换液继续培养，待细胞融合度>80％时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养；每当细胞融合度达到80％-90％时传代一次，每次按1:3到1:6比例传代，直到P6代；(2)脐带间充质干细胞上清液：收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中，放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液，将上清转移到Nalgene1000ml方形瓶中储存备用；(3)凝胶的配制：称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌，将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中，再依次加入2份DMSO、35份无菌PBS，于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h，然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备：向步骤(2)脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵，每升加入3ml的5％医用苯扎溴铵；再按1:2比例加入步骤(3)凝胶混合均匀，按3ml/支分装到预充式注射器中；将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准，用手指将针帽拧开，再推动推杆，使管体内的空气排除，管体内液体无法流出为最佳，然后拧紧针帽，具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。根据上述技术方案，优选地，脐带保存液包括50mlHyCloneDMEM/F-12培养基以及100U/ml庆大霉素；原代无酚完全培养基包括HyCloneDMEM/F-12的无酚红培养基以及体积浓度2％的血清替代物；扩增无酚完全培养基包括HyCloneDMEM/F-12无酚红培养基以及体积浓度1％血清替代物。根据上述技术方案，优选地，按照份数比，凝胶粉末包括8份海藻酸丙二醇酯、2份普鲁兰以及1份硬脂酸钠。本专利技术的有益效果是：(1)采用了血清替代物代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞，有效避免了细胞上清液中残留胎牛血清中的动物源成分，提高了产品的安全性，适合各种哺乳动物包括人类使用。(2)本专利技术凝胶内含有细胞生长因子，可以与表皮细胞发生作用，促进上皮细胞新陈代谢，迅速修复受损细胞，加速表面伤口愈合，避免形成疤痕，同时还能使老化的皮肤恢复光滑与弹性。附图说明图1示出了根据本专利技术的实施例的制备流程示意图。图2示出了根据本专利技术的实施例的原代脐带间充质干细胞示意图。图3示出了根据本专利技术的实施例的P6代脐带间充质干细胞示意图。图4示出了根据本专利技术的实施例的脐带间充质干细胞表面标志物CD105检测结果示意图。图5示出了根据本专利技术的实施例的脐带间充质干细胞表面标志物CD34检测结果示意图。具体实施方式为了使本
的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本专利技术作进一步的详细说明。如图所示，本专利技术提供了一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定：a.脐带取样以及检测：取健康足月新生儿脐带8-12cm，置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测；b.脐带清洗：用浸润有75％酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒，然后在生物安全柜内打开瓶盖，用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75％酒精浸润2-4秒后迅速取出，并转移到一个新的200ml无菌杯中，然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次；c.脐带处理：将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中，用止血钳挤压血管排空血管中的血液，用生理盐水继续清洗干净；用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中，用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块；d.脐带间充质干细胞培养：使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中，每瓶150-300块，然后将培养瓶竖起，沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基；拧上瓶盖，翻转培养瓶，使接种组织块的瓶壁在上，放置于37℃，5％CO2的培养箱中静置贴壁4h以上；之后翻转培养瓶，让培养基完全浸润每一块组织块，置于培养箱中培养；前七天保持培养瓶静止，第七天半量换液，第十二天观察到较多纤维状细胞爬出，此时工作人员去除组织块，半量换液继续培养，待细胞融合度>80％时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养；每当细胞融合度达到80％-90％时传代一次，每次按1:3到1:6比例传代，直到P6代；(2)脐带间充质干细胞上清液：收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中，放到离心机内以3000rpm转速、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定：a.脐带取样以及检测：取健康足月新生儿脐带8‑12cm，置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外采集母体外周血3‑5ml用于病毒五项检测；b.脐带清洗：用浸润有75％酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒，然后在生物安全柜内打开瓶盖，用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75％酒精浸润2‑4秒后迅速取出，并转移到一个新的200ml无菌杯中，然后用生理盐水将脐带反复清洗3‑5次；c.脐带处理：将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中，用止血钳挤压血管排空血管中的血液，用生理盐水继续清洗干净；用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中，用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块；d.脐带间充质干细胞培养：使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中，每瓶150‑300块，然后将培养瓶竖起，沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基；拧上瓶盖，翻转培养瓶，使接种组织块的瓶壁在上，放置于37℃，5％CO2的培养箱中静置贴壁4h以上；之后翻转培养瓶，让培养基完全浸润每一块组织块，置于培养箱中培养；前七天保持培养瓶静止，第七天半量换液，第十二天观察到较多纤维状细胞爬出，此时工作人员去除组织块，半量换液继续培养，待细胞融合度>80％时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养；每当细胞融合度达到80％‑90％时传代一次，每次按1:3到1:6比例传代，直到P6代；(2)脐带间充质干细胞上清液：收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中，放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液，将上清转移到Nalgene 1000ml方形瓶中储存备用；(3)凝胶的配制：称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌，将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中，再依次加入2份DMSO以及35份无菌PBS，于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h，然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备：向步骤(2)所述脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵，每升加入3ml的5％医用苯扎溴铵；再按1:2比例加入步骤(3)所述凝胶混合均匀，按3ml/支分装到预充式注射器中；将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准，用手指将针帽拧开，再推动推杆，使管体内的空气排除，管体内液体无法流出为最佳，然后拧紧针帽，具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。...

【技术特征摘要】
1.一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定：a.脐带取样以及检测：取健康足月新生儿脐带8-12cm，置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测；b.脐带清洗：用浸润有75％酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒，然后在生物安全柜内打开瓶盖，用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75％酒精浸润2-4秒后迅速取出，并转移到一个新的200ml无菌杯中，然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次；c.脐带处理：将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中，用止血钳挤压血管排空血管中的血液，用生理盐水继续清洗干净；用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中，用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块；d.脐带间充质干细胞培养：使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中，每瓶150-300块，然后将培养瓶竖起，沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基；拧上瓶盖，翻转培养瓶，使接种组织块的瓶壁在上，放置于37℃，5％CO2的培养箱中静置贴壁4h以上；之后翻转培养瓶，让培养基完全浸润每一块组织块，置于培养箱中培养；前七天保持培养瓶静止，第七天半量换液，第十二天观察到较多纤维状细胞爬出，此时工作人员去除组织块，半量换液继续培养，待细胞融合度>80％时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养；每当细胞融合度达到80％-90％时传代一次，每次按1:3到1:6比例传代，直到P6代；...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈继广，鲁振宇，洪敬欣，张冰晶，
申请(专利权)人：天津欣普赛尔生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12