一种再生因子的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：体外培养脐带来源的间充质干细胞；在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。该种再生因子为干细胞分泌的多种可溶性蛋白，纯度较高，且去除了原细胞培养基的影响，使用效果得到提升。

Preparation and Application of a Regeneration Factor

The invention discloses a preparation method of regeneration factor, which includes the following steps: culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in vitro; discarding the original culture medium when the cell convergence rate reaches a certain level when the cell culture reaches a certain algebraic level, gently cleaning the cell twice with normal saline, removing the residual culture medium as far as possible, then adding normal saline, and continuing to culture. Cells secrete a variety of factors, which dissolve into normal saline to form cell secretion; collect supernatant to centrifuge in centrifugal tube to remove tissue and cell fragments; freeze-dry or freeze-store the supernatant in refrigerator for a long time to prepare regeneration factors. The regeneration factor is a kind of soluble protein secreted by stem cells with high purity, and removes the influence of the original cell culture medium. The effect of using the regeneration factor is improved.

【技术实现步骤摘要】
一种再生因子的制备方法及应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种再生因子的制备方法及应用。
技术介绍
近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、转化生子因子-a(TGF-a)、前列腺素E2、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等，这些可溶性细胞因子可以有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，抑制T淋巴细胞的增殖；参神经系统的修复和再生；参与损伤衰老细胞的增生分化等。目前的基础研究提示，间充质干细胞可以应用于神经细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞等的再生，从而用于治疗神经损伤、脱发、美容等。而目前临床上对于上述部分疾病暂时没有非常有效的方法。以脱发为例：男性雄激性秃发系统冶疗最有效的冶疗方案主要是口服非那雄胺，联合局部外用米诺地尔。脱发严重者则采取毛发移植手术(王羿婷，孙蔚凌，范卫新.非那雄胺和米诺地尔治疗雄激素性秃发的临床研究[J].临床皮肤科杂志，2011,40(7)：387-390.)。但是非那雄胺口服并不适用于女性激素性脱发、休止期脱发如产后脱发增加或者绝经后脱发(赵辨.中国临床皮肤病学[M].南京:江苏科学技术出版社，2010:1185-1190.)。但现有的治疗方法缺点较多，效果有限，可引起头痛、瘙痒、毛发移植价格昂贵，移植后有排斥、脱落率大、操作不方便等。而使用干细胞手术治疗，费用昂贵，操作不便，安全风险较高。对于间充质干细胞治疗疾病的机理的进一步研究发现，干细胞治疗这类疾病很重要的原因之一是其强大的外泌能力，通过细胞分泌的多种细胞因子，及外泌体携带的小分子核酸和更小分子如PFG2等的作用来发挥辅助治疗疾病的功效。而这些分泌到胞外的物质即本文所述再生因子。因此再生因子可用于辅助治疗神经损伤性疾病、脱发，使用方便简单易操作，而不存在干细胞输注可能引起的出血、感染等手术风险。另一方面，在美容行业，皮肤抗衰的治疗手段多样，但很多都会对皮肤造成物理性损伤。传统上所谓的干细胞美容，异体的通常会引起免疫排斥反应，而且存在一定的伦理问题。自体的一般采用脂肪干细胞，取材痛苦、有感染风险，而且脂肪组织会游走，维持的时间较短。因此，将某些细胞因子添加到美容化妆品，常见的如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)等，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，细胞因子的作用越来越受到人们的关注，但这种单一的添加通常效果有限。因此含多种细胞因子的化妆品可有效改善肌肤状态，保湿美白肌肤，修复受损肌肤，同时缓解敏感肌，而几乎无安全风险。此外，本方法提前将细胞原培养液去除，替换为生理盐水，使得再生因子糖分等杂质含量降低，避免使用时出现皮肤干燥等不良效果，使用舒适感提升。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对提供了一种再生因子的制备方法及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；步骤2、在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；步骤3、收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。可选地，所述步骤1中的体外培养脐带来源的间充质干细胞具体为：步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液浸泡清洗至脐带发白，无血迹；步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；步骤1.5、加入1ml无血清培养基润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补充完全培养基到10ml，重新于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，期间尽量不用力摇晃培养皿，以免贴牢的组织块发生脱落而漂浮；步骤1.7、组织块培养1周后，倒置显微镜下观察，有长梭状细胞从组织块边缘爬出，即为目标细胞群；此时对细胞进行全量换液，轻轻吸弃原培养基，再沿侧壁小心加入新鲜培养基，保证组织块尽量不脱落；步骤1.8、以后每3天半量更换培养基，每日镜下观察细胞生长状态，细胞由单个克隆团逐步汇合生长；步骤1.9、当细胞生长至80％融合时，弃去组织块及非贴壁细胞；用工程化重组胰蛋白酶消化液消化细胞，按1∶5比例传代。可选地，步骤2中的细胞培养到的代数为第三代-第五代；细胞汇合率达到70％-80％。可选地，步骤2中的生理盐水的添加量为15-25ml，继续培养时间为20-30小时。可选地，步骤3中的离心转速为1800-2200rmp，离心时间为8-12min。可选地，步骤4中的冰箱的冻存温度为-80℃。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)该种再生因子为干细胞分泌的多种可溶性蛋白，纯度较高，且去除了原细胞培养基的影响，使用效果得到提升。2)将该种再生因子冻干后可将保存时间由原来的一周延长至6个月，大大延长其保质期，同时更加轻便，保存温度要求由4℃变为常温，更便于携带和保存。3)本专利技术再生因子与自体外周血prp二联制剂可延缓毛囊萎缩、使原有的静止期毛囊恢复为生长期、帮助原有生长期毛发直径增加，促进伤口愈合，有效促进毛囊存活。4)本专利技术再生因子可促进神经细胞的增殖再生，辅助治疗神经损伤性疾病。5)本专利技术再生因子可营养滋润皮肤，缓解皱纹的生成，改善肤质。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。本专利技术公开了一种再生因子的制备方法，包括以下步骤：步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液(Solarbio公司)浸泡清洗至脐带发白，无血迹；步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管(1根脐静脉，2根脐动脉)和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；步骤1.5、加入1ml无血清培养基(Lonza，瑞士)润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养；步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补充完全培养基到10ml，重新于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱(Thermo公司，美国)中培养，期间尽量不用力摇晃培养皿，以免贴牢的组织块发生脱落而漂浮；步骤1.7、组织块培养1周后，倒置显微镜下观本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种再生因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；步骤2、在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；步骤3、收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。

【技术特征摘要】
1.一种再生因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、体外培养脐带来源的间充质干细胞；步骤2、在细胞培养到一定代数时，当细胞汇合率达到一定程度时，将原培养基弃去，用生理盐水轻轻清洗细胞两遍，尽量去除残留的培养基原液，然后加入生理盐水，继续培养，细胞会分泌多种因子，因子溶解到生理盐水中，形成细胞分泌液；步骤3、收集上清液至离心管中离心，去除组织块、细胞碎片；步骤4、将上清液分装后冻干或冻存于冰箱，长期保存，制备得到再生因子。2.根据权利要求1所述的再生因子的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的体外培养脐带来源的间充质干细胞具体为：步骤1.1、脐带转移至无菌培养皿，加10mlPBS缓冲液浸泡清洗至脐带发白，无血迹；步骤1.2、将脐带组织剪成5cm的均匀小段，剥离3根血管和脐带外表皮，剩下的部分称为华通氏胶；步骤1.3、将华通氏胶用无菌眼科剪尽量剪碎，剪碎成1mm3小块；步骤1.4、将剪碎的组织块均匀铺于新的培养皿底部，组织块间的距离小于5mm；步骤1.5、加入1ml无血清培养基润湿组织块，翻转培养皿待其贴牢，置37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；步骤1.6、隔天将培养皿翻转正置，补...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋丽萍，张娟，罗旭梅，彭芳芳，张泽辛，黄娟，吴克琴，杨燕，肖春，胡火珍，薛红，
申请(专利权)人：四川驰鼎盛通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51