骨保护素的S77突变体蛋白及其相关产品与应用制造技术

本发明专利技术公开了骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。该骨保护素的突变体蛋白与野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素。实验证明，本发明专利技术的骨保护素的突变体蛋白与相应的野生相比，抑制RANKL诱导破骨细胞分化能力无显著差别，并可以克服野生型抑制TRAIL抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。

S77 Mutant Protein of Osteoprotegerin and Its Related Products and Applications

The invention discloses a mutant protein of osteoprotegerin and related products and applications. Compared with wild-type osteoprotegerin, the mutant protein of the osteoprotegerin replaces the 77th amino acid residue of the full-length sequence of the wild-type osteoprotegerin; the mutant protein has affinity to RANKL, but the affinity of the mutant protein to TRAIL is lower than that of the wild-type osteoprotegerin. Experiments show that the mutant protein of the osteoprotegerin has no significant difference in inhibiting the differentiation ability of osteoclasts induced by RANKL compared with the corresponding wild type, and can overcome the defect of the wild type in inhibiting the anti-tumor effect of TRAIL, thus playing a more effective and safe role in preventing and treating bone resorption-related diseases.

【技术实现步骤摘要】
骨保护素的S77突变体蛋白及其相关产品与应用
本专利技术涉及生物
中骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。
技术介绍
以骨质疏松症、关节炎为代表的骨吸收相关疾病是世界常见的多发病，已严重影响了人类健康。骨吸收相关疾病的病理特征为骨吸收―形成失平衡，而调节骨吸收和形成平衡的最重要的信号传导通路被证明是OPG/RANKL/RANK系统。在该系统中，骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)作为中心环节，发挥着至关重要的作用。1997年，美国和日本两个研究组同期发现了OPG蛋白。它属于TNF受体超家族成员，为可溶性、分泌性糖蛋白，由401个氨基酸组成，表达于成骨细胞/骨间质细胞中，是目前发现的唯一的破骨细胞负向调节因子。因考虑到OPG对破骨细胞的重要调节作用，上述两个研究组立即开始查找与OPG密切相关的蛋白，发现了其配体—核因子-кB受体活化因子配体(receptoractivatorofNF-κBligand，RANKL)和破骨细胞表面膜受体RANK(thereceptoractivatorofNF-κB)。短短2年，OPG/RANKL/RANK系统为人们所认识，回答了成骨细胞调控破骨细胞的准确机制：OPG相当于整个OPG/RANKL/RANK系统的制动器。它作为RANKL的假受体，竞争性抑制RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞活性和分化,对抗骨质疏松，因此RANKL/OPG比例成为骨质疏松致病机制中的关键因素。许多激素和细胞因子(例如TGF-β、PTH、1，25-VD3、糖皮质激素和雌激素)都通过OPG通路起作用。骨质疏松小鼠注射OPG后，骨密度明显上升，而OPG基因敲除小鼠表现为严重骨质疏松。OPG防治骨质疏松的重要作用被揭示后，成为竞相追捧的“明星蛋白”。世界最大的生物公司-Amgen尝试开发的OPG-Fc曾进入到临床Ⅱ期研究，初步实验表明OPG能够抑制人体骨吸收，对抗骨质疏松。Amgen公司甚至和美国航空航天局(NASA)合作开展了OPG预防废用性骨质疏松症的太空实验。正当OPG作为抗骨质疏松药物的研发蓬勃开展的时候，Amgen公司却在2005年停止了对该蛋白的研发投入，放弃了关于OPG的进一步研究。其它实验室对OPG的研究也近于停滞。其原因之一是发现OPG存在着缺陷，影响了其临床应用：RANKL的结构与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)相似，OPG与RANKL结合的同时也能与TRAIL结合，抑制了TRAIL的抗癌作用，加大肿瘤发生的风险。TRAIL是一种人体自分泌的蛋白，其能特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显细胞毒作用。2006年澳大利亚EvoGenix公司申请了一种OPG突变体衍生物的专利(US2006/0189528A1)，其所涉及的基因突变位点主要为I115，R122和F128。通过这些位点氨基酸的替换，降低OPG突变体与TRAIL的结合能力，从而减少其促进肿瘤发生的危险。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何在保留野生型骨保护素的抑制RANKL介导的破骨细胞活化的能力的情况下，降低野生型骨保护素对TRAIL的抗癌作用的抑制。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了野生型骨保护素的突变体蛋白，所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对核因子-кB受体活化因子配体(RANKL)的亲和活性但是所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的亲和活性低于所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性。上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素包括野生型骨保护素的全长片段，也包括野生型骨保护素的活性片段。上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可来源于任何物种，如来源于哺乳动物的骨保护素，如人。上述突变体蛋白中，人野生型骨保护素的全长氨基酸序列是SEQIDNo.10，如GenBankAccessionNumberNP_002537.3(26-JUN-2017)所示。上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可为人野生型骨保护素的活性片段。所述人野生型骨保护素的活性片段的氨基酸序列可为全长序列的第22-201位氨基酸残基。上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白包括任何在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代的变异蛋白，无论是截短的还是全长的，无论是单体形式还是二聚体形式。上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白和所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性和对TRAIL的亲和活性之间的比较是基于大小相似的蛋白质进行的。上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性可为所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性是所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性的70％以上。上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性为所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性是所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性的25％以下。上述突变体蛋白中，所述70％以上可为a1)-a10)中的任一种：a1)大于等于76％至等于100％；a2)大于等于80％至等于100％；a3)大于等于81％至等于100％；a4)大于等于82％至等于100％；a5)大于等于83％至等于100％；a6)大于等于84％至等于100％；a7)大于等于85％至等于100％；a8)大于等于90％至等于100％；a9)大于等于95％至等于100％；a10)77％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、90％、95％或100％。上述突变体蛋白中，所述25％以下可为b1)-b9)中的任一种：b1)、小于等于20％至等于0或小于等于20％至小于等于16％；b2)、小于等于16％至等于0或小于等于16％至小于等于13％；b3)、小于等于13％至等于0或小于等于13％至小于等于11％；b4)、小于等于11％至等于0或小于等于11％至小于等于10％；b5)、小于等于10％至等于0或小于等于20％至小于等于5％；b6)、小于等于5％至等于0或小于等于5％至小于等于3％；b7)、小于等于3％至等于0或小于等于3％至小于等于1％；b8)、小于等于1％至等于0；b9)、11％、8％、7％、6％或5％。上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白可为将所述野生型骨保护素的第77位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。所述其它氨基酸残基本领域技术人员可根据所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性和对TRAIL的亲和活性确定，只要能使所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性满足上述a1)-a10)中任一种，对TRAIL的亲和活性满足上述b1)-b9)中的任一种要求的其它氨基酸残基均可选用。所述其它氨基酸可从r1)至r4)中选择：r1)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.野生型骨保护素的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素对所述TRAIL的亲和活性。

【技术特征摘要】
1.野生型骨保护素的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性但是所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性低于所述野生型骨保护素对所述TRAIL的亲和活性。2.根据权利要求1所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白具有对RANKL的亲和活性为所述突变体蛋白对RANKL的亲和活性是所述野生型骨保护素对RANKL的亲和活性的70％以上。3.根据权利要求1或2所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于所述野生型骨保护素为所述突变体蛋白对TRAIL的亲和活性是所述野生型骨保护素对TRAIL的亲和活性的25％以下。4.根据权利要求3所述的突变体蛋白，其特征在于：所述70％以上为a1)-a10)中的任一种：a1)大于等于76％至等于100％；a2)大于等于80％至等于100％；a3)大于等于81％至等于100％；a4)大于等于82％至等于100％；a5)大于等于83％至等于100％；a6)大于等于84％至等于100％；a7)大于等于85％至等于100％；a8)大于等于90％至等于100％；a9)大于等于95％至等于100％；a10)77％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、90％、95％或100％；和/或，所述25％以下为b1)-b9)中的任一种：b1)、小于等于20％至等于0或小于等于20％至小于等于16％；b2)、小于等于16％至等于0或小于等于16％至小于等于13％；b3)、小于等于13％至等于0或小于等于13％至小于等于11％；b4)、小于等于11％至等于0或小于等于11％至小于等于10％；b5)、小于等于10％至等于0或小于等于20％至小于等于5％；b6)、小于等于5％至等于0或小于等于5％至小于等于3％；b7)、小于等于3％至等于0或小于等于3％至小于等于1％；b8)、小于等于1％至等于0；b9)、11％、8％、7％、6％或5％。5.根据权利要求1至3中任一所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白是将所述野生型骨保护素的第77位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。6.根据权利要求5所述的突变体蛋白，其特征在于：所述其它氨基酸为C1或C2：C1、非极性氨基酸或极性氨基酸；C2、所述其它氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸。7.根据权利要求6所述的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白为D1至D5中的任一种：D1、氨基酸序列是SEQIDNo.6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，尚腾飞，
申请(专利权)人：北京济全生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11