PD-1和4-1BB的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及融合蛋白，其包含(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含位于其N‑端的源自PD‑1或CD40L的多肽；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内结构域，所述细胞内结构域包含位于其C‑端的源自4‑1BB或CD28的多肽。本发明专利技术也设想CD28位于N‑端和CD40L位于C‑端的融合蛋白。本发明专利技术还涉及编码该融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本发明专利技术进一步涉及用于产生该宿主细胞的方法。最后，本发明专利技术涉及包含该融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物组合物，特别用于治疗与PD‑1/PD‑L2或CD40结合和/或PD‑L1/PD‑L2或CD40表达相关的疾病或障碍，如癌症和慢性病毒感染。

Fusion protein of PD-1 and 4-1BB

The present invention relates to a fusion protein comprising (a) an extracellular domain containing a polypeptide originating from PD_1 or CD40L at its N_end; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular domain containing a polypeptide originating from 4_1BB or CD28 at its C_end. The present invention also envisages a fusion protein of CD28 at the N terminal and C D40L at the C terminal. The invention also relates to a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a carrier containing the nucleic acid molecule and a host cell containing the carrier. The present invention further relates to a method for producing the host cell. Finally, the present invention relates to pharmaceutical compositions containing the fusion protein, nucleic acid molecules, vectors and/or host cells, in particular for the treatment of diseases or disorders associated with the binding of PD_1/PD_L2 or CD40 and/or the expression of PD_L1/PD_L2 or CD40, such as cancer and chronic viral infections.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】PD-1和4-1BB的融合蛋白
本专利技术涉及融合蛋白，其包含(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含位于其N-端的源自PD-1或CD40L的多肽；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内结构域，所述细胞内结构域包含位于其C-端的源自4-1BB或CD28的多肽。本专利技术也设想CD28位于N-端和CD40L位于C-端的融合蛋白。本专利技术还涉及编码该融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本专利技术进一步涉及用于生产该宿主细胞的方法。最后，本专利技术涉及包含该融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物组合物，特别用于治疗与PD-1/PD-L2或CD40结合和/或PD-L1/PD-L2或CD40表达相关的疾病或障碍，如癌症和慢性病毒感染。
技术介绍
肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移(TIL)是一种有希望的抗肿瘤治疗选择(Rosenberg等,Science(2015),348:62-68)。不幸的是，不是所有的肿瘤实体都能分离和表达TIL。因此，发展出了用转基因T细胞受体(TCR)基因改造T细胞的概念(Hurwitz等,CancerMicroenviron(2014),7:1-9)。然而，迄今这样的T细胞存活期短，且在患者体内失去功能(Janicki等,CancerRes(2008),68:2993-3000；Bai等,PNASUSA(2008),105:13003-13008；Bendle等,CancerRes(2004),64:8052-8056；Anderson等,JImmunol(2007),178:1268-1276)。通过CD28等共刺激受体的TCR信号转导级联的共刺激可增强T细胞的增殖、存活和细胞毒性(Chen等,NatRevImmunol(2013),13:227-242)。但是，因为上皮肿瘤不表达共刺激受体CD28的配体(CD80/86)，且人效应T细胞本身对这样的受体是阴性的，因此共刺激不能按照保守的方式发生。为了向T细胞提供独立于这种经典方式的共刺激，产生了嵌合共刺激受体。它们由共抑制受体PD-1(也称为CD279)的细胞外结构域和CD28的信号传导结构域组成(Ankri等,JImmunol(2013),4121-4129；Prosser等,MolImmunol(2012),263-272；WO2013/019615)。通常，肿瘤特异性T细胞在表面上表达PD-1，PD-1与其表达在肿瘤细胞上的配体PD-L1结合。这一结合引起TCR-信号传导和T细胞活化的阻断，因而导致所述肿瘤特异性T细胞的抑制。为了共刺激TCR信号传导(进而增加T细胞活化)，刺激CD28会是很必要的；参见如上所述。包含PD-1和CD28结构域的嵌合共刺激受体应当表现出两者的相关功能，一方面是PD-1的细胞外受体功能，另一方面是CD28的细胞内信号传导功能。在这种已经呈现过的嵌合构建体中(Ankri，参见上文；Prosser，参见上文；WO2013/019615)，跨膜结构域取自相应的信号传导分子。然而，尽管这样的构建体已经被描述来减少PD-L1介导的T细胞抑制以及增加T细胞活化，依然需要进一步改进这种构建体。
技术实现思路
如本文所述和权利要求书中限定的本专利技术已经解决了这一技术问题。本专利技术涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)细胞外结构域(ECD)，所述细胞外结构域包含位于其N-端的源自PD-1或CD40L的多肽；(b)跨膜结构域(TMD)；和(c)细胞内结构域(ICD)，所述细胞内结构域包含位于其C-端的源自4-1BB或CD28的多肽。优选地，根据本专利技术，如果所述细胞外结构域(ECD)包含位于其N-端的源自PD-1的多肽，所述细胞内结构域(ICD)就包含位于其C-端的源自4-1BB的多肽；反之亦然。类似地，如果所述细胞外结构域包含位于其N-端的源自CD40L的多肽，所述细胞内结构域就包含位于其C-端的源自CD28的多肽；反之亦然。对于具有源自CD40L的ECD和源自CD28的ICD的融合蛋白，同样可能ICD位于TMD的N-端，而所述TMD正好位于所述融合蛋白的C-端；参见图8所示的作为示例的(而非限制性的)融合蛋白。在本专利技术的一个实施方案中，所述细胞外结构域(a)包含位于其N-端的源自PD-1的多肽和位于其C-端的源自4-1BB的多肽。相比CD28，4-1BB(CD137)是在T细胞亚群上呈现的一种共刺激受体，能够增强TCR信号传导能力。4-1BB是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，在原初T细胞中不存在，但在T细胞刺激和分化为效应细胞后被诱导(Cheuk等,CancerGeneTher(2004),11:215-226)。4-1BB的细胞内结构域包含QEE基序，该基序在与4-1BBL连接后在APC上表达，招募TNFR相关因子2(TRAF2)(Arch等,MolCellBiol(1998),18:558-565；Nam等,JImmunol(2005),174:1898-1905)。TRAF2激活包括ERK的MAPK通路，并激活NFκB的核转位(Watts,AnnuRevImmunol(2005),23:23-68)。它由此增强细胞因子产生和T细胞存活。因此，本专利技术提供包含PD-1的细胞外结构域(ECD)和4-1BB的细胞内结构域(ICD)或由PD-1的细胞外结构域(ECD)和4-1BB的细胞内结构域(ICD)组成的融合(本文也称为“嵌合”)蛋白。在本专利技术的进一步方面，设想了一种融合蛋白，该融合蛋白包含位于其N端的源自CD28的ICD、源自CD40L的ICD的片段、CD40L的TMD和位于其C端的源自CD40L的ECD(图8)。在本专利技术的一个实施方案中，所述融合蛋白包含SEQINNO:29中所示的氨基酸序列或由SEQINNO:29中所示的氨基酸序列组成。进一步地，本专利技术提供一种融合(嵌合)蛋白，该融合(嵌合)蛋白包含CD40L的细胞外结构域(ECD)和CD28的细胞内信号传导结构域(ICD)。在T细胞中表达，在本专利技术的上下文中，已令人惊奇地发现当与表达其受体CD40的细胞相互作用时，这种嵌合蛋白发挥双重功能：在T细胞中，认为它启动共刺激途径，从而提供存活和增强的效应子活性(顺式效应)。在相互作用的CD40细胞(反式效应)中，即在肿瘤细胞、肿瘤内皮细胞中，认为它引起细胞死亡；而在相互作用的细胞是抗原呈递细胞的情况下，认为它能够诱导进一步支持T细胞活性的细胞因子(如IL-12)的分泌(图7)。一般而言，在本专利技术的上下文中，除非本文中另有规定，否则包含源自PD-1的细胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TMD)和源自4-1BB的细胞内结构域(ICD)或由源自PD-1的细胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TMD)和源自4-1BB的细胞内结构域(ICD)组成的融合蛋白也在本文称为“PD-1:4-1BB”或“PD-1:BB”。类似地，包含源自PD-1的细胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TMD)和源自CD28的细胞内结构域(ICD)或由源自PD-1的细胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TMD)和源自CD28的细胞内结构域(ICD)组成的融合蛋白也在本文称为“PD-1:CD28”。类似地，包含源自CD40L的细胞外结构域本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含位于其N‑端的源自PD‑1的多肽；(b)源自PD‑1或4‑1BB的跨膜结构域；和(c)细胞内结构域，所述细胞内结构域包含位于其C‑端的源自4‑1BB的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.23 LU LU930061.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含位于其N-端的源自PD-1的多肽；(b)源自PD-1或4-1BB的跨膜结构域；和(c)细胞内结构域，所述细胞内结构域包含位于其C-端的源自4-1BB的多肽。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜结构域包含源自PD-1的多肽。3.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含CD3δ结构域。4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞外结构域不包含接头或铰链结构域。5.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，由所述细胞外结构域和/或由所述跨膜结构域包含的所述源自PD-1的多肽是源自人PD-1的多肽。6.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，由所述跨膜结构域和/或由所述细胞内结构域包含的所述源自4-1BB的多肽是源自人4-1BB的多肽。7.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，包含源自PD-1的多肽的所述细胞外结构域包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白显示出PD-L1/2结合亲和力。8.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，包含源自4-1BB的多肽的所述细胞内结构域包含与SEQIDNO:4的氨基酸序列相比具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到CD8+T细胞中时，能够在所述CD8+T细胞用PD-L1/2+靶细胞刺激时提高所述CD8+T细胞的增殖率。9.根据权利要求2至8中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，包含源自PD-1的多肽的所述跨膜结构域包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列相比具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到CD8+T细胞中时，能够在所述CD8+T细胞用PD-L1/2+靶细胞刺激时增加IFNγ和/或IL-2的分泌。10.根据前述权...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·诺瑟纳，R·施伦克，S·韦斯，
申请(专利权)人：德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE