芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物制造技术

本发明专利技术公开了一种芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术还公开了厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物，及其检测海洋生物污染的方法。有益效果为：首次通过基因克隆技术克隆获得厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其在厚壳贻贝的消化腺和腮中的相对表达量最高，可用于检测海洋污染，标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

Aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation protein ARNT: a new marker for marine biological pollution detection

The present invention discloses an aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation protein ARNT, whose nucleotide sequence is SEQ ID NO.1 and its amino acid sequence is SEQ ID NO.2. The invention also discloses the aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation protein ARNT of mussel, which is used as a novel marine biological pollution detection marker and a method for detecting marine biological pollution. The beneficial effects are as follows: for the first time, aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation protein ARNT of mussel was cloned by gene cloning technology. The relative expression of ARNT in the digestive gland and parotid gland of mussel is the highest, and it can be used to detect marine pollution. The marker has strong specificity. It can directly react with target cells or target molecules in organisms at the molecular level to conduct sensitive biological reactions to the sea. Ocean pollutant exposure and toxicity have early warning effect.

【技术实现步骤摘要】
芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物
本专利技术属于分子生物
，具体涉及芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物。
技术介绍
厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)(贻贝科)是生长最快的海洋双壳贝类之一，广泛分布于黄海，朝鲜半岛和日本北海道海域。由于其营养丰富，味道鲜美，广泛受到海洋贝类生产量最大的中国大规模养殖市场和知名度的欢迎。近年来，中国海域海洋环境污染呈现加剧趋势。此外，作为较低的物种，厚壳贻贝缺乏适应性免疫系统，这会引起外部刺激的脆弱性。这种贻贝种类受到病毒，细菌甚至重度精神和有机污染物所产生的疾病打击，导致显着的经济损失。阐明厚壳贻贝免受环境刺激的免疫防御机制，有助于制定新的疾病防治管理策略和文化产业的长期可持续性。近年来，随着工农业的迅猛发展，近海遭到不同程度的污染，特别是石油工业和海上交通运输业的发展，使得石油成为近海中最主要的污染物，石油污染不仅能使鱼、虾、贝类海产品变味，严重时能产生毒性效应，给海洋生态环境和渔业资源带了严重危害；同时，由于重金属易在底质中蓄积，不易降解，往往被生物富集，对人体健康具有潜在的威胁，重金属污染也是当今世界普遍关注的环境问题之一，重金属铜污染主要是由采矿排放出的废水和废气、城市工业和生活污水(包括一些钢铁、电子产品等)无节制的排放等致使水质中或土壤中重金属含量增加，导致重金属污染达到无法承受的地步，并造成生态环境的严重恶化，铜污染一直是重金属污染中的一个重要方面，铜污染越来越受到人们的重视。有研究表明，生物组织中标志物活性(含量)与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。芳香烃受体核转位蛋白(arylhydrocarbonreceptornucleartranslocator，ARNT)是一个转录因子，它属于碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)转录因子超家族中新发现的PAS(periodicity[Per]/arylhydrocarbonreceptornucleartranslocator[ARNT]/single-minded[Sim])亚家族，该家族的成员均以一个高度保守的毗邻于螺旋-环-螺旋二聚化区域的碱性DNA结合序列为特征，是一类生物传感器。它与芳香烃受体(arylhydrocarbonreceptor，AhR)、低氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor1a，HIF1a)、哺乳动物生理节律调节蛋白CLOCK、21三体综合征临界因子、HIFlike因子/上皮细胞特异因子(HLF/EPAS)，以及各种转录调节辅助因子，如SRC-1、TIF-2、核受体共活化物ACTR同属于PAS亚家族。ARNT作为一个反式作用因子，通过与基因启动子中的顺式作用元件特异结合并发生相互作用，从而激活或抑制特定基因的转录和翻译。这些转运蛋白在各种组织，包括鳃，外套膜，性腺，消化腺，肌肉，血细胞，肝胰腺等组织中表达出来，在各种各样的化合物的上升、分布和排泄中发挥了至关重要的作用，这些蛋白质作为细胞的第一道防线，在细胞的解毒过程中发挥着重要作用。目前还未有报道将厚壳贻贝ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术获得的厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其在消化腺和腮中的相对表达量最高，克隆用引物合适、能增大PCR反应的成功性。本专利技术的目的之二在于提供一种利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记，标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。本专利技术的目的之三在于提供一种基于厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的新型海洋生物污染检测标记在在海洋污染检测中的应用。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其核苷酸序列为SEQIDNO.1：ATGGCCTCTTCAACAATATCTCCAGGACCATCAGGATCTGGAGATGGAGGCAAGGGAGGCAACAGAAAAAGGAAAGGTGTTAATCATAAAGATTCTGATGATGAAGATAGCCAGCAAAGCACACCATATAACCAGGAACAAATTGACAAAGAAAAGTTTGCTAGGGAGAGCCATTGTGAGATTGAGAGAAGAAGAAGAAACAAGATGACCTCCTACATTAATGAACTCTGTGATATGGTACCAACATGCAGTACCTTAGCTAGGAAACCAGACAAACTAACCATTCTTAGAATGGCTGTTTCTCACATGAAAACACTCCGGGGTACTGGCAATACAGGAACTGATGGGTCGTATAAACCTTCTTTCCTCACAGACCAGGAGTTAAAACATCTCATTCTAGAGGCAGCAGATGGATTCCTGTTTGTTGTACAATGTGATACGGGGAGAATAATATATGTGTCTGACTCAGTGACACCAGTTCTTCACCAGTCTATGAATGAATGGTTTGGAAACTGCGTCTATGAACTGATCCACCCAGATGATATAGACAAAGTAAGAGAACAGCTTTCCACGACAGAATCTCAAAACACAGGAAGAATTCTAGATTTGAAAACTGGAACAGTTAAAAAAGACAGTCATCAAACCTCTATTAGACTATGTATGGGGTCCAGGAGAGGTTTTATATGTAGAATGAAGATGGGTAATGTCCAGGTTGATCCAATGACAGCCAATCATTCCTTACGTGTCCGTCAGCGTAACACCATTGGTCCGTCTAATGATGGGAATCATTATACGGTTGTACATGTCACTGGGTATATAAAGAACTGGCCACCTTCAGGTGTACAGATTGATAGAGATCCTGATGAGAATTCTGGTCCCGGCAGCCATTGTTGTTTGGTTGCCATTGGTAGACTGCAGGTGACTAGTGCACCTAACTGTAATGATTTAATGGGAGCTAACAATGCCACAGAGTTCGTTTCCAGACACAGTATAGAGGGCAAATTTACTTTTGTCGACCAGAGGGTAACAGCTTTACTTGGTTATCAACCACAGGAATTGCTAGGAAAATCAGCTTTTGATTTTTATCACCCTGAAGATAAAACACACATGAAGGATACTTTTGAACAAGTGTTAAAGTTGAAAGGTCAAGTGATGTCTATAATGTACAGATTTAGAGCAGCTAATAATGACTGGGTATGGTTGAGAACCAGTAGCTTTAGTTTCCAGAATCCTTATACTGATGAAGTAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO.2。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的芳香烃受体核转位蛋白。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。4.权利要求1-3任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，包括：准备样品、提取总RNA、合成cDNA第一链、克隆核心序列、PCR产物的克隆及序列分析、生物信息学分析，其特征在于：所述芳香烃受体核转位蛋白ARNT克隆核心序列中PCR扩增的简并引物为：ARNT01F：5′-TGTACCGGGCCCATCAAAGCTTGGCC-3′和ARNT02R：5′-CACGTCTGACTAAGGAGGCTGAAA-3′。5.根据权利要求4所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：准备样品：取健康均匀的厚壳贻贝在温度20～25℃，pH值8.0条件下饲养；提取总RNA：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA；合成cDNA第一链：以获得的总RNA样品作为模板，oligo(dT)20为反转录引物反转录合成，获得cDNA第一链；克隆核心序列：使用简并引物ARNT01F和ARNT02R，以上述cDNA为模板，用TaqDNA聚合酶(TaKaRa)PCR扩增出核心序列；克隆全长序列：分别设计引物扩增3′RACE和5′RACE未知片段，将3′端、5′端和核心片段序列进行拼接；PCR产物的克隆及序列分析：PCR产物经电泳纯化、回收后克隆至pMD18-T载体，转化感...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭宝英，刘硕博，祁鹏志，唐祖蓉，叶莹莹，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33