本发明专利技术公开了灰飞虱致死基因片段Transcription factor IIB及其应用。本发明专利技术筛选出经干扰后能够导致灰飞虱死亡的序列如SEQ ID NO.1所示的灰飞虱致死基因片段Transcription factor IIB，利用该基因片段的dsRNA饲喂灰飞虱、褐飞虱，可有效地致死灰飞虱、褐飞虱，本发明专利技术对环境生态和食品都安全，为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。
【技术实现步骤摘要】
灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB及其应用
本专利技术属于农业生物
，涉及灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB及其应用。
技术介绍
在我国，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种农药产生了不同程度的抗性，需要不断加大农药使用量才能达到满意的防治效果，造成了更为严重的环境污染，形成恶性循环。另外灰飞虱传播条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病，发病后药剂控制效果较差，只能依靠治虫防病。因此，在农业生产实践中，急需化学农药之外的替代防治手段。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象，双链RNA最终被加工大小约为22nt的小RNA(siRNA),通过序列配对的方式与蛋白编码基因结合，根据序列配对的程度降解靶标基因mRNA或抑制基因的蛋白翻译过程。RNAi广泛地存在于真菌、植物和动物中。2006年AndreFire和CraigMello因发现RNAi现象被授予诺贝尔医学与生理奖。在生物体中，一些重要的基因对维持生命是必须的。从理论上而言，如果利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，则会引起害虫的致畸或致死，从而达到控制害虫的目的。我们团队致力于昆虫的RNA干扰研究，先前的研究实现对Ribosomal+protein+L9-B、Tubulin、Chitinase、Chitinase+7、ADP-ribosylation+factor、Alpha1-tubulin等基因的有效干扰，并将其应用于害虫防治。本专利专利技术从灰飞虱中筛选出经干扰后能够导致飞虱死亡的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB及其应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB，序列如SEQIDNO.1所示。所述的灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的克隆方法，包括如下步骤：(1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；(2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQIDNO.2的上游引物P1、序列为SEQIDNO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养，过夜；(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQIDNO.1所示的TranscriptionfactorIIB基因片段。其中，所述的RT-PCR扩增体系为：反应缓冲液5μL，Mg2+4μL，dNTP4μL，cDNA模板2μL，上游引物P11μL，下游引物P21μL，R-Tag酶0.5μL，ddH2O32.5μL，共50μL；所述的反应程序为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸。灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA，序列如SEQIDNO.4所示。所述的灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA的合成方法，是以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQIDNO.5的上游引物P3、序列为SEQIDNO.6的下游引物P4，PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA。所述的灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA的合成方法优选包含如下步骤：(1)根据已经验证的TranscriptionfactorIIB基因片段序列，设计并合成序列为SEQIDNO.5的上游引物P3和序列为SEQIDNO.6的下游引物P4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA，PCR体系为：反应缓冲液5μL，Mg2+4μL，dNTP4μL，cDNA模板2μL；上游引物P32μL，下游引物P42μL，ExTap酶0.25μL，ddH2O30.75μL，共50μL；PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38个循环，72℃延伸。(2)PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；(3)回收目标产物。一种杀灭飞虱的方法，其特征在于，将灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA与饲料混合后饲喂飞虱；优选地，所述的飞虱为灰飞虱或褐飞虱；优选地，所述dsRNA的浓度为3000-8000ng/μl。一种飞虱的dsRNA饲喂方法，包含如下步骤：(1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻璃管另一端封好；(2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜，贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；(3)用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；(4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26℃，利用飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料；优选地，所述的飞虱为灰飞虱或褐飞虱；优选地，所述的dsRNA优选本专利技术的灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA。有益效果：1、利用RNAi技术沉默TranscriptionfactorIIB基因，对灰飞虱、褐飞虱具有明显的致死效果，说明该基因可作为利用RNA干扰技术控制害虫的有效靶点。2、本专利技术合成的TranscriptionfactorIIB基因dsRNA能有效沉默TranscriptionfactorIIB基因，更好地抵抗RNA酶的降解，同时合成成本较低，便于大规模应用。3、本专利技术TranscriptionfactorIIB基因的RNAi对灰飞虱、褐飞虱具有显著的致死效果，为建立利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。具体实施方式实施例11.TranscriptionfactorIIB基因片段的克隆方法：(1)取灰飞虱10-20头，用TRIzol法提取总RNA；(2)合成cDNA第一条链；(3)从灰飞虱转录组中获取基因片段序列，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/进行同源性比对之后，预测为灰飞虱TranscriptionfactorIIB基因，利用Primerpremier5.0软件设计P1和P2，以RT-PCR方法进行扩增；上游引物(P1):5'CGAGCTTCTCAAAAAAT3'(SEQIDNO.2)，下游引物(P2):5'GCAAAAACAAATATTAT3'本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.灰飞虱致死基因片段Transcription factor IIB，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB，其特征在于，序列如SEQIDNO.1所示。2.一种扩增权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的引物，其特征在于，包含以序列为SEQIDNO.2的上游引物P1、序列为SEQIDNO.3的下游引物P2。3.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段TranscriptionfactorIIB的dsRNA，其特征在于,序列如SEQIDNO.4所示。4.权利要求3所述的灰飞虱致死基因片段Transcriptionfacto...
【专利技术属性】
技术研发人员：王亚琴，王书平，李飞，贺康，肖花美，胡涛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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