一种具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术的抗菌肽来源于拟穴青蟹，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码序列如SEQ ID NO.2所示，该抗菌肽的制备包括如下步骤：提取拟穴青蟹的总RNA作为模板，进行反转录获得cDNA；以cDNA作为模板进行PCR扩增获得含抗菌肽编码序列的核苷酸片段，扩增产物与表达载体通过酶切、连接、转化，构建可表达重组抗菌肽的大肠杆菌工程菌，大肠杆菌工程菌通过诱导培养，表达出重组抗菌肽。本发明专利技术的抗菌肽具有良好的抑菌、抗病毒活性，可用于制备抑菌剂或抗病毒剂，有良好的应用前景。

An Antimicrobial Peptide with Complex Biological Activity and Its Preparation Method and Application

The invention discloses an antimicrobial peptide with compound biological activity, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of molecular biology. The antimicrobial peptide of the present invention originates from Pointed Green Crab, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO.1 and coding sequence is shown in SEQ ID NO.2. The preparation of the antimicrobial peptide includes the following steps: extracting the total RNA of Pointed Green Crab as a template, reverse transcription to obtain the cDNA; using the DNA as a template, PCR amplification to obtain the nucleotide fragment containing the coding sequence of the antimicrobial peptide, amplification products and expression vectors. E. coli engineering bacteria expressing recombinant antimicrobial peptides were constructed by digestion, ligation and transformation. E. coli engineering bacteria expressed recombinant antimicrobial peptides through induction culture. The antimicrobial peptide of the invention has good antimicrobial and antiviral activities, and can be used to prepare antimicrobial or antiviral agents, and has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种拟穴青蟹来源具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用。
技术介绍
在先天免疫的基础上，脊椎动物进化出了可以不断丰富的获得性免疫系统。这种免疫方式的出现，使得生物体在进化过程中具有了更广泛的免疫形式，同时从被动防御型的免疫方式转化成为了主动的免疫方式。然而，对于无脊椎动物来说，先天免疫系统是它们防御细菌、病毒、寄生虫等病原微生物侵染的唯一免疫防御形式，这个系统主要包括细胞免疫与体液免疫两种类型。细胞免疫主要涉及到结节的形成、包囊作用、细胞吞噬作用三种类型。体液免疫主要包括抗菌肽的形成与黑化作用。其中，抗菌肽分子被认为是一类重要的能够针对细菌和真菌的入侵，发挥免疫效应的蛋白质分子。目前，发现的抗菌肽分子种类较多，其中有一类分子的结构比较典型，在其氨基酸序列中存在着一个乳清酸性蛋白结构域(WAPdomain)，这个结构域的特点是存在着由8个半胱氨酸残基形成的4对二硫键。根据分子中存在的WAP结构域的个数，人为地将其分为具有单个WAP结构域的抗菌肽分子(SWD)和具有双WAP结构域的抗菌肽分子(DWD)。多数抗菌肽分子不仅可以在甲壳类动物体内发挥清除细菌、真菌的作用，也可以在体外行使抗细菌、除真菌的功能。因此，将甲壳类动物内源性的抗菌肽基因进行体外大量表达与纯化之后，这些蛋白质在家畜青储饲料的防霉抗菌、家畜颗粒状饲料的防霉抗菌、假牙的清洁、隐形眼镜的除菌清洁、图书馆典藏珍贵书籍的防霉抗菌等方面，会具有非常广阔的应用前景，它们可以成为良好的绿色无污染的抗菌添加剂。需要指出的是，抗菌肽与目前广泛使用的抗生素、化工类的抗菌剂有着很大的区别：(1)源于甲壳类动物的抗菌肽分子发挥抗菌作用的同时，不会引起耐药性问题，因为抗菌肽分子发挥作用的过程是直接作用于细菌、真菌的细胞壁，从而引起细菌、真菌细胞壁某一部位的水解产生漏洞而引起细菌、真菌细胞的内溶物外泄，使其死亡而被清除，这类抗菌肽分子在医药行业也存在较大的应用前景。(2)源于甲壳类动物的抗菌肽分子发挥抗菌作用的同时，不会造成环境污染，这类抗菌肽分子在家畜养殖业的饲料储存方面、假牙的清洗和隐形眼镜的消毒方面、珍贵古老图书的收藏方面、水果蔬菜远距离运输过程的抗菌除霉方面存在较大的应用前景。拟穴青蟹属于甲壳纲、十足目、青蟹属，是一种重要的水产经济养殖动物，在我国东南沿海养殖规模较为广泛。在过去的20年间，拟穴青蟹的养殖过程被白斑综合症病毒和弧菌以及其他一些细菌的侵染所困扰，细菌与病毒对于拟穴青蟹的感染给相关养殖行业带来了较大的经济损失。同时，一些科学研究结果也显示：拟穴青蟹在受到细菌或者白斑综合症病毒刺激的情况下，体内的crustin抗菌肽基因在mRNA和蛋白质水平都会被显著的上调表达，来对抗细菌或者病毒的侵染，说明拟穴青蟹crustin抗菌肽是一类重要的内源性抗菌以及抗病毒效应分子。因此，深入研究拟穴青蟹的crustin抗菌肽基因对于进一步完善无脊椎动物先天免疫系统的基础理论有重要的意义之外，还可以为其在家畜养殖业饲料储存过程的抗菌除霉、人造假牙的清洗除菌和隐形眼镜的消毒除菌方面、珍贵古老图书收藏过程的防霉除菌方面，水果、蔬菜远距离运输过程的抗菌除霉等方面的具体应用，开发出具有良好前景的绿色无污染的抗菌除霉生物活性添加剂。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种来源于拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)新的具有复合生物活性的抗菌肽。本专利技术的另一目的在于提供所述抗菌肽的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述抗菌肽的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种来源于拟穴青蟹新的具有复合生物活性的抗菌肽，命名为Sp-Crustin6，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具有113个氨基酸残基。进一步地，拟穴青蟹体内，编码上述抗菌肽的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，长342bp。一种上述抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：(1)以提取的拟穴青蟹总RNA作为模板，以5’-CTGGGAAGAAATGACATG-3’作为反转录引物进行反转录PCR得到cDNA。(2)以cDNA作为模板进行PCR扩增获得含上述抗菌肽编码序列的核苷酸片段，PCR扩增引物如下：F：5′-NnGGGAGGCCTAGTCCTTCT-3′，R：5′-NnCTATGGGTCAGCAAGCAG-3′，其中，Nn由保护碱基和限制性内切酶酶切位点组成，N表示任意碱基，n为自然数，可根据相应的表达载体进行调整。(3)步骤(2)的扩增产物与表达载体通过酶切、连接、转化，构建可表达重组抗菌肽的大肠杆菌工程菌。(4)步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌通过诱导培养，表达出重组抗菌肽。本专利技术对重组抗菌肽与常见病原菌进行了结合实验、液体抑菌实验，以及与白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP26结合实验、体内抑制WSSV增殖实验，结果显示本专利技术的抗菌肽具有良好的抑菌、抗病毒活性。因此，本专利技术的抗菌肽可用于制备抑菌剂或抗病毒剂。一种抑菌剂或抗病毒剂，包含本专利技术的抗菌肽。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术的抗菌肽具有良好的凝集细菌、结合细菌、抑制细菌、抑制真菌、抑制WSSV病毒增殖的活性，在家畜养殖业饲料储存过程的抗菌除霉，人造假牙的清洗除菌和隐形眼镜的消毒除菌方面，珍贵古老图书收藏过程的防霉除菌方面，水果、蔬菜远距离运输过程的抗菌除霉等方面有着良好的应用前景。附图说明图1是SDS-PAGE检测重组拟穴青蟹抗菌肽rSp-Crustin6诱导表达与亲和纯化的结果图。泳道1是诱导前大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道2是IPTG诱导后的大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道3是纯化后的rSp-Crustin6重组蛋白质，泳道M是标准的蛋白质分子量。图2是重组拟穴青蟹抗菌肽rSp-Crustin6与常见病原菌结合实验的结果图。图3是重组拟穴青蟹抗菌肽rSp-Crustin6与WSSV囊膜蛋白VP2的结合实验结果，A为rSp-Crustin6的结果，B为GST的结果。图4是重组拟穴青蟹抗菌肽rSp-Crustin6对WSSV的活体抑制试验结果图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1拟穴青蟹抗菌肽基因Sp-crustin6的克隆、重组表达与纯化本专利技术的具有复合生物活性的抗菌肽Sp-Crustin6，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；编码抗菌肽Sp-Crustin6的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。按照下述步骤对抗菌肽Sp-Crustin6进行重组表达和纯化。(1)利用动物总RNA提取试剂盒提取拟穴青蟹肌肉、肝胰腺、鳃、肠、眼柄5种等质量组织的混合组织样品的总RNA，获得拟穴青蟹混合组织的总RNA样品。(2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹总RNA样品作为模板，以特异引物5’-CTGGGAAGAAATGACATG-3’作为反转录合成反应的后引物，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得拟穴青蟹混合组织样品的cDNA样品。(3)设计扩增拟穴青蟹抗菌肽基因Sp-crustin6编码区表达片段(成熟肽)的前后引物Sp-crustin6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的抗菌肽的核苷酸，其特征在于：序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以提取的拟穴青蟹总RNA作为模板，以5’-CTGGGAAGAAATGACATG-3’作为反转录引物进行反转录PCR得到cDNA；(2)以cDNA作为模板进行PCR扩增获得含权利要求1所述抗菌肽编码序列的核苷酸片段，PCR扩增引物如下：F：5′-NnGGGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜志强，沈秀丽，李新苍，王凯，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15