荧光蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种荧光蛋白的纯化方法。本发明专利技术提供的荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到荧光蛋白。该纯化方法简便高效，适用于所有表达系统中荧光蛋白的纯化，安全对环境没有污染，纯化成本低，纯化得到的荧光蛋白纯度高并且浓度高，该方法适用于工业化的生产与应用。

Purification of fluorescent protein

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to providing a purification method of fluorescent protein. The purifying method of the fluorescent protein provided by the invention purifies the cell wall-breaking fluid after precipitation and resolving in turn and purifies it by ion exchange chromatography to obtain the fluorescent protein. The purification method is simple and efficient. It is suitable for the purification of fluorescent protein in all expression systems. It is safe and environmentally friendly. The purification cost is low. The purified fluorescent protein has high purity and concentration. This method is suitable for industrial production and application.

【技术实现步骤摘要】
荧光蛋白的纯化方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种荧光蛋白的纯化方法。
技术介绍
1962年，旅居美国的日本科学家下村修对一种发光水母产生了兴趣，因为他发现这种水母在受到外界的惊扰后会发射绿色荧光。在从美国西海岸打捞了大约5万只发光水母后，通过艰苦的提取纯化工作，最终得到数百毫克的蛋白，其在508nm下自行发射绿色荧光，称之为绿色荧光蛋白。后人的研究发现，通过改造绿色荧光蛋白的氨基酸序列，在一个或数个位点进行突变，可以得到不同颜色的荧光蛋白如黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白和青色荧光蛋白等。荧光蛋白无需辅助因子和底物即可自行发射荧光，这一特性使其在生物实验中得到了广泛的应用。在实际应用中，某些场合需要一定量的高纯度荧光蛋白，此时，利用基因工程的方法来获得荧光蛋白，相较于从天然来源中提取的方法显然更简便、经济。基因工程的方法具体为：通过在表达载体上插入目的基因，然后将表达载体导入到相应的宿主细胞中，通过培养和诱导即可大量表达目的基因对应的蛋白。同时，因为荧光蛋白不需要翻译后修饰，选择原核表达系统来表达是合理的。大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，它的优势是分子操作简单，可在廉价的培养基中快速生长，且外源蛋白表达量通常较高。虽然很多蛋白在大肠杆菌中表达易形成无活性的包涵体沉淀，但可以通过优化培养和诱导的条件得到可溶性表达的目标产物。荧光蛋白一般都在胞内表达，细胞破碎后，荧光蛋白和菌体自身蛋白及其它大分子物质混杂在一起，因此，要将不带任何标签的荧光蛋白从细胞破碎后的溶液中分离纯化出来是一件困难的事情。目前，利用荧光蛋白的一些特性，如耐受一定的有机溶剂、相对耐热、不易变性等，已经开发了一些分离纯化不带任何标签的荧光蛋白的方法，如双液相萃取、有机溶剂抽提、热处理等，但这些方法均存在纯化倍数低、工艺复杂、易引发环境污染等缺点。因而，寻找一种简单高效、经济同时适合大规模应用的荧光蛋白纯化方法显得十分必要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种荧光蛋白的纯化方法，以缓解现有技术中荧光蛋白的纯化方法纯化倍数低、工艺复杂、易引发环境污染等技术问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到所述荧光蛋白。进一步地，所述沉淀包括在所述细胞破壁液中加入Zn2+，得到沉淀蛋白的步骤。进一步地，在所述细胞破壁液中加入Zn2+后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取沉淀得到所述沉淀蛋白。进一步地，所述Zn2+的浓度为2-200mM，优选为10-50mM，进一步优选为20mM。进一步地，所述复溶包括将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用Tris缓冲液进行溶解，得到复溶溶液的步骤；优选地，将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用Tris缓冲液进行溶解后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取上清得到所述复溶溶液。进一步地，所述离子交换层析的层析步骤包括：用NaCl浓度为90-110mM的Tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，洗脱得到的溶液为纯化的荧光蛋白；优选地，先用NaCl浓度为40-60mM的Tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，再进行用NaCl浓度为90-110mM的Tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱的步骤。进一步地，所述结合有荧光蛋白的离子交换层析柱通过将所述复溶得到的复溶溶液加入到离子交换层析柱得到；优选地，所述离子交换层析柱在加入所述复溶溶液前经过Tris缓冲液平衡处理；优选地，所述复溶溶液加入所述离子交换层析柱后还包括用Tris缓冲液冲洗所述结合有荧光蛋白的离子交换层析柱的步骤；优选地，所述离子交换层析柱为阴离子交换层析柱。进一步地，所述细胞破壁液经过热处理后再进行沉淀的步骤，所述热处理的条件包括：在60-70℃条件下，80-120rpm/min孵育10-20min；优选地，所述热处理后还包括在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min的步骤，得到所述细胞破壁液。进一步地，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或青色荧光蛋白。进一步地，所述Tris缓冲液的浓度为30-70mM，pH值为7.5-8.5，优选为50mM，pH8.0。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到荧光蛋白。通过沉淀将荧光蛋白从细胞破壁液中沉淀下来，可以实现荧光蛋白与细胞破壁液中的其他物质的快速分离，起到初步纯化的效果。由于沉淀的选择性不高，这一过程中会有一些杂蛋白跟随荧光蛋白一起沉淀出来，通过复溶这一步骤可以将荧光蛋白从沉淀步骤得到的沉淀蛋白中复溶到溶液中，大部分的杂蛋白依然存在于沉淀蛋白中，以实现荧光蛋白的进一步纯化。为了得到高纯度的荧光蛋白，将复溶得到的复溶溶液通过离子交换层析进行更进一步的纯化，可以使荧光蛋白与杂蛋白分离，得到高纯度的产品。该纯化方法简便高效，适用于所有表达系统中荧光蛋白的纯化，安全对环境没有污染，纯化成本低，纯化得到的荧光蛋白纯度高并且浓度高，该方法适用于工业化的生产与应用。附图说明图1为本专利技术实施例3中荧光蛋白纯化的SDS-PAGE效果图；图2为本专利技术实施例4中DEAE层析纯化的SDS-PAGE效果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到荧光蛋白。通过沉淀将荧光蛋白从细胞破壁液中沉淀下来，可以实现荧光蛋白与细胞破壁液中的其他物质的快速分离，起到初步纯化的效果。由于沉淀的选择性不高，这一过程中会有一些杂蛋白跟随荧光蛋白一起沉淀出来，通过复溶这一步骤可以将荧光蛋白从沉淀步骤得到的沉淀蛋白中复溶到溶液中，大部分的杂蛋白依然存在于沉淀蛋白中，以实现荧光蛋白的进一步纯化。为了得到高纯度的荧光蛋白，将复溶得到的复溶溶液通过离子交换层析进行更进一步的纯化，可以使荧光蛋白与杂蛋白分离，得到高纯度的产品。该纯化方法简便高效，适用于所有表达系统中荧光蛋白的纯化，安全对环境没有污染，纯化成本低，纯化得到的荧光蛋白纯度高并且浓度高，该方法适用于工业化的生产与应用。需要说明的是，一般情况下荧光蛋白的表达都利用各宿主细胞表达系统，荧光蛋白的纯化分离首先要对宿主细胞进行破碎处理，使得细胞内的物质释放出来，对宿主细胞进行细胞破碎处理，通过离心将细胞膜等不溶杂质去除后得到的溶液即为细胞破壁液。在本专利技术一个优选地实施方式中，细胞破壁液中的溶液为Tris缓冲液。利用Tris缓冲液有利于荧光蛋白的沉淀，同时有利于提高后续的离子交换层析纯化处理工艺的效果。在本专利技术一个优选地实施方式中，沉淀包括在细胞破壁液中加入Zn2+，得到沉淀蛋白的步骤。利用Zn2+可以可逆的沉淀荧光蛋白这一特性，将荧光蛋白从细胞破壁液中沉淀出来，实现荧光蛋白的初步纯化。该步骤简单易操作，避免了使用有机溶剂易引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光蛋白的纯化方法，其特征在于，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到所述荧光蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种荧光蛋白的纯化方法，其特征在于，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到所述荧光蛋白。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述沉淀包括在所述细胞破壁液中加入Zn2+，得到沉淀蛋白的步骤。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，在所述细胞破壁液中加入Zn2+后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取沉淀得到所述沉淀蛋白。4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述Zn2+的浓度为2-200mM，优选为10-50mM，进一步优选为20mM。5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述复溶包括将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用Tris缓冲液进行溶解，得到复溶溶液的步骤；优选地，将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用Tris缓冲液进行溶解后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取上清得到所述复溶溶液。6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析的层析步骤包括：用NaCl浓度为90-110mM的Tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，洗脱得到的溶液为纯化的荧光蛋白；优选地，先用NaCl浓度为40-60mM的Tris缓冲液对结合有荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅向阳，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31