一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用。本发明专利技术屋尘螨过敏原Der p 33基因如SEQ ID NO：2所示，该重组蛋白由屋尘螨过敏原Der p 33基因经表达、纯化后得到，序列如SEQ ID NO：1所示。该重组蛋白用于制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面。本发明专利技术首次发现屋尘螨Der p 33基因序列全长，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于Western blotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率18.75％(3/16)，而对照组无阳性。

【技术实现步骤摘要】
一种屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白及其应用
本专利技术属于变态反应学领域，尤其涉及一种屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白及其在制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。
技术介绍
尘螨(Housedustmite)泛指灰尘里滋生的所有螨类，按界、目、纲、门、科、属、种进行分类，其种类繁多，常见的为粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)屋尘螨(D.pteronyssinus)，也是我国大陆最常见的两种螨。根据我国呼吸道过敏性疾病科研及流调协作组(ChinaAllianceofResearchonRespiratoryAllergicDisease,CARRAD)皮肤点刺试验结果，粉尘螨阳性率为59.0％、屋尘螨阳性率为57.6％，说明这是不同的致敏螨种，其对过敏性疾病实验诊断具有不同的临床价值。过敏体质者吸入尘螨分泌物、排泄物及尸体的降解产物后可发生Ⅰ型变态反应，引起哮喘、鼻炎及异位性皮炎等多种变态反应性疾病，采用药物治疗可以暂时缓解症状，但是不能根除疾病。大量临床试验表明，采用变应原特异性免疫治疗(allergen-specificimmunotherapy，SIT)具有特异性、持久改善病情等优点。但是，临床采用变应原来源物质制备出的粗提浸液为多种变应原的混合物，不同批次粗提浸液含有的变应原种类不稳定，主要变应原组分的含量不稳定，并可能含有非变应原物质、某些免疫原性偏低的变应原、毒性蛋白等，用于临床治疗会引起局部和全身的不良反应，甚至危及生命。每种螨均可以产生上千种蛋白，有的是过敏原，有的不是。能够引起尘螨过敏性疾病患者机体内产生特异性IgE抗体、并与过敏性疾病患者血清在体内发生结合的螨虫成份称为过敏原组分(Groups)。系统地鉴定、表征这些组分，对两种螨的临床应用具有重要的价值。迄今，临床诊断均采用粉尘螨和/或屋尘螨粗提物为抗原建立免疫学检验方法。由于螨体粗提物中含有多种过敏原组分，同一组分在不同批次产品中含量不一致，很难实现产品的标准化。因此，了解每种螨的过敏原组分，制备过敏原单组分生物制品，基于单组分建立检验方法，精准检测过敏性疾病患者是因某种组分或是某些组分致敏，为临床制订精准脱敏治疗方案提供依据。国际过敏原命名委员会已经命名了粉尘螨过敏原第33组分Derf33，但是没有公布屋尘螨第33组分Derp33及其编码基因。粉尘螨过敏原却无法替代屋尘螨过敏原，这是因为，二者即使具有一定的序列相似，但即便只是相差1个氨基酸也会引起临床误诊，更何况是不同物种之间具有相似序列的蛋白质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白及其应用，该重组蛋白用于精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面，旨在解决现有尘螨引起的过敏性疾病无法得到精准医学检测的问题。本专利技术是这样实现的，一种屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白，该基因的DNA序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术进一步公开了上述屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白在精准医学检测屋尘螨引起过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。优选地，所述诊断试剂或生物制品为屋尘螨过敏原Derp33基因经表达、纯化后的重组蛋白，或者所述诊断试剂或生物制品包括屋尘螨过敏原Derp33基因经表达、纯化后的重组蛋白。本专利技术提供一种屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白及其应用。本专利技术通过转录组测序后，进行序列比对，得到一个片段与粉尘螨第33组分Derf33高度同源的序列，将该片段扩出来，然后通过cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends，RACE)获得编码基因全长，然后进行基因克隆表达纯化，将纯化的蛋白质与屋尘螨过敏患者血清进行Westernblotting，发现该基因编码的蛋白质具有高度的活性，并最终确定该序列为屋尘螨过敏原第33组分编码基因，如SEQIDNO：2所示，通过该基因得到Derp33基因重组蛋白，如SEQIDNO：1所示。相比现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次发现屋尘螨Derp33基因序列全长，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于Westernblotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率18.75％(3/16)，而对照组无阳性。附图说明图1是屋尘螨过敏原Derp33已知序列验证；其中，M：DL2,000DNAMarker；1：F1/R1第1stPCR产物；2：负对照；3：F2/R2第2ndPCR产物；4：负对照；图2是屋尘螨过敏原Derp33已知基因片段经3'RACE获得的序列琼脂糖凝胶电泳；其中，M：DL2,000DNAMarker；1：3′RACE第1次PCR产物；2：3′RACE第2次PCR产物；图3是屋尘螨过敏原Derp33经3'RACE序列验证琼脂糖凝胶电泳；其中，M：DL2,000DNAMarker；1：F1/R1扩增产物；2：负对照；3：F2/R2扩增产物；4：负对照；图4是屋尘螨过敏原Derp33全长基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳；其中，M：DL2,000DNAMarker；1：目的基因PCR扩增产物。图5是空质粒pET28a(+)经BamHI/NotI双酶切后电泳图；其中，M2：λ-HindⅢdigest(CodeNo.3403)；1：pET28a(+)质粒对照；2：pET28a(+)-BamHI/NotI；图6是pET28a(+)-Derp33转化大肠杆菌表达SDS-PAGE图像；其中，M1为ProteinMWmarker(Broad)，1为pET28a(+)全细胞，2为pET28a(+)上清，3为pET28a(+)沉淀，4为pET28a(+)-Derp33转化大肠杆菌的全细胞，5为pET28a(+)-Derp33转化大肠杆菌的上清，6为pET28a(+)-Derp33转化大肠杆菌的沉淀；图7SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白；其中，M为ProteinMWmarker(Broad)，1为pET28a(+)-Derp33转化大肠杆菌的表达产物、8μL上样，2为pET28a(+)-Derp33转化大肠杆菌的表达产物、12μL上样，3为BSA200ng，4为BSA400ng，5为BSA600ng，6为BSA800ng，7为BSA1000ng；图8Westernblotting鉴定纯化后的重组蛋白；其中，M1为PrecisionPlusProteinStandards，18μL重组蛋白上样；M2为Perfectproteinmarker；图9是WB检测重组蛋白rDerp33与过敏性疾病患者血清IgE结合率。第7、11、14号血清样本有阳性条带。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一、已知序列验证1、引物设计与合成名称序列(5′-3′)长度(mers)F1TCGTCGTCTATTTCATCCAG20R1ACCATTACGTGTATTACATT20F2TGAACAATGTTCCGGTTTAC20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种屋尘螨过敏原Derp 33基因重组蛋白，其特征在于，该蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白，其特征在于，该蛋白序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的屋尘螨过敏原Derp33基因重组蛋白在制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔玉宝，杜晓燕，钱俊，周鹰，吴国荣，陈越新，郁志伟，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32