The invention belongs to the technical field of nucleic acid detection, in particular to a method and kit for detecting mycoplasma contamination in cell culture medium at constant temperature. The method of the invention includes: constructing reaction system, including: RPA constant temperature amplification reaction components, specific amplification of Mycoplasma primer pairs, Cas12a protein, targeted target sequence crRNA and single-stranded DNA reporter molecule; taking 1 mL cell culture supernatant, heating culture, taking 1 uL as detection sample, adding to the integrated detection system, after reaction, the fluorescence change of the detection system can be observed directly. The kit contains: primer pairs amplifying conserved 16S rRNA region DNA sequence of Mycoplasma, RPA isothermal amplification reaction components, Cas12a protein, complementary crRNA with target gene and single stranded DNA reporter molecule modified by fluorescent and quenching groups at both ends. The invention has the advantages of simple operation, short inspection period and solving the problem of open cover pollution in the process of routine Mycoplasma detection.
【技术实现步骤摘要】
恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒
本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒。
技术介绍
支原体是细胞培养过程中最常见和最不易觉察的污染物。支原体是一类缺乏细胞壁、具有高度多样性，大小介于细菌和病毒之间的一种原核生物，可通过常规的滤菌器，能够在培养基中独立存在，自行繁殖。支原体污染对细胞有多方面的影响，细胞被支原体污染之后，培养基pH值变化明显，培养基更换几小时就变为黄色，并且细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生变化，细胞状态变差，转染效率降低等等，这导致实验结果不准确。因此，在细胞培养过程中进行支原体检测和预防十分必要。目前，检测细胞培养中支原体污染的方法有很多种，常用的有HoechstDNA荧光染料法，直接培养法，酶联免疫吸附（ELISA）实验法和聚合酶链式反应（PCR）方法等，每种方法各有利弊，相比较于其它方法，PCR法操作相对简单且检测灵敏度较高，能够在支原体污染早期检出，是目前最常用的支原体污染检测方法，但PCR法也有明显的缺点：PCR产物的电泳需要用到EB等致癌物质；需要用到PCR仪，电泳槽，凝...
【技术保护点】
1.一种检测细胞培养中支原体污染的方法，称为一步法，其特征在于，具体步骤如下：（1）构建一体化检测的反应体系，体系中包含：RPA恒温扩增反应成分，特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对，RNA酶抑制剂，Cas12a蛋白，靶向目标序列的crRNA和单链DNA报告分子，记为记为ssDNA；（2）取1mL细胞培养上清液，95℃ ~ 98 ℃加热培养2min ~ 5min，取1uL作为检测样品加入到24uL一体化检测体系中，37℃经过反应25min ~ 45min，通过蓝光切胶仪直接观察检测体系荧光变化进行支原体检测；发黄绿色荧光说明有支原体污染，不发光说明没有...
【技术特征摘要】
1.一种检测细胞培养中支原体污染的方法，称为一步法，其特征在于，具体步骤如下：（1）构建一体化检测的反应体系，体系中包含：RPA恒温扩增反应成分，特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对，RNA酶抑制剂，Cas12a蛋白，靶向目标序列的crRNA和单链DNA报告分子，记为记为ssDNA；（2）取1mL细胞培养上清液，95℃~98℃加热培养2min~5min，取1uL作为检测样品加入到24uL一体化检测体系中，37℃经过反应25min~45min，通过蓝光切胶仪直接观察检测体系荧光变化进行支原体检测；发黄绿色荧光说明有支原体污染，不发光说明没有支原体污染；其中：所述特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对序列为：SEQ.ID.NO1、SEQ.ID.NO2；所述靶向目标序列的crRNA序列为：SEQ.ID.NO3；所述RNA酶抑制剂为RibonucleaseInhibitor（TakaRa）；所述单链报告分子序列为：5‘6-FAM-TTATT-3’BHQ1；所述的crRNA直接合成，或者由T7体外转录得到；体外转录体系中引物对序列为：SEQ.ID.NO4、SEQ.ID.NO5。2.根据权利要求1所述的检测细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于，反应体系中：特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物浓度为0.36uM；扩增片段长度为300bp；crRNA浓度为1000nM；ssDNA浓度为200nM；反应体系中，RPA反应组分中的反应催化剂为buffer2.1（NEB）。3.根据权利要求2所述的检测细胞培养中支原体污...
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