一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：a)胎肝干细胞的分离和扩增；b)胎肝干细胞的鉴定；(2)胎肝干细胞的诱导分化：a)在干冰上低温收集正常肝脏组织研磨匀浆后制成的组织悬液，离心后收集上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养以获得肝祖细胞；b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养以获得肝样细胞；c)将步骤b)所获得的细胞用加入含HGF的细胞快速扩增培养基培养，以获得有功能的肝细胞，能快速、准确、高效地将我们前期获得的胎肝干细胞诱导分化为具有功能的肝细胞。

A three-step sequential method for inducing differentiation of fetal hepatic stem cells into mature hepatocytes

The invention discloses a three-step sequential method for inducing fetal liver stem cells to differentiate into mature hepatocytes, which belongs to the field of biotechnology, including the following steps: (1) acquisition and identification of fetal liver stem cells: (a) isolation and expansion of fetal liver stem cells; (b) identification of fetal liver stem cells; (2) induction and differentiation of fetal liver stem cells; (a) collection of normal liver tissue on dry ice at low temperature after grinding homogenate. After centrifugation, the supernatant was collected and added to Williams'E cell culture medium, and the fetal hepatic stem cells in step (1) were cultured to obtain hepatic progenitor cells; b) the cells obtained in step a were cultured in Williams' E medium with Notch signaling pathway inhibitor to obtain hepatocyte-like cells; c) the cells obtained in step B were rapidly expanded by adding HGF-containing cells. In order to obtain functional hepatocytes, we can quickly, accurately and efficiently induce and differentiate the fetal hepatic stem cells we obtained earlier into functional hepatocytes.

【技术实现步骤摘要】
一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法
本专利技术属于生物技术的
，具体涉及一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法。
技术介绍
原位肝移植是治疗终末期肝病的金标准。但是，肝源的短缺成为了肝细胞移植在临床应用上最大的瓶颈，限制的其有效开展。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。同时，大量研究证实，细胞疗法是治疗终末期肝病(End-stageliverdiseases,ESLDs)有效的方法之一，应用前景十分光明。胎肝干/祖细胞(FLSPCs)具有成活率高，增殖量小，安全性高等优点，是用于肝脏疾病的干细胞治疗理想的细胞之一。在我们研究的早期阶段，我们申请了一种三步分离方法来富集FLSPCs，并获得与流式细胞分选方法相似的分离效率。并且，使用暴发性肝衰竭大鼠模型，我们证明FLSPCs可以促进肝形态发生和功能的恢复。业已证实，胎肝干细胞是一种双向分化潜能的多能干细胞。在适当的信号通路的调节下，肝干细胞可以分化为成熟的肝细胞和胆管细胞。从而完成肝脏的损伤修复。胎肝干细胞能表达干细胞表面标志物，如CD133、EpCAM、CD49f、Dlk本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：1)胎肝干细胞的分离培养和扩增；2)胎肝干细胞的鉴定；(2)胎肝干细胞的诱导分化：a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6‑8天；b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养6‑8天；c)将步骤b)所获得的细胞用加入含有HGF因子的细胞快速扩增培养基，继续快速扩增6‑8天，以获得有功能的肝细胞。

【技术特征摘要】
1.一种三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)胎肝干细胞的获得与鉴定：1)胎肝干细胞的分离培养和扩增；2)胎肝干细胞的鉴定；(2)胎肝干细胞的诱导分化：a)在干冰上低温收集正常肝脏组织进行研磨匀浆，制作成组织悬液，离心后收集上清液，将上清液加入Williams’E细胞培养基，并对步骤(1)中的胎肝干细胞进行培养6-8天；b)将步骤a)所获得的细胞用加入Notch信号通路抑制剂的Williams’E培养基，继续培养6-8天；c)将步骤b)所获得的细胞用加入含有HGF因子的细胞快速扩增培养基，继续快速扩增6-8天，以获得有功能的肝细胞。2.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中进行胎肝干细胞的诱导分化过程所采用的具体步骤如下：a、利用含肝脏组织上清液的培养基启动胎肝干细胞向肝细胞分化；b、利用含有Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂的培养基加速胎肝干细胞向肝细胞分化；c、利用含有肝脏成熟因子HGF的培养基完成胎肝干细胞向肝细胞分化。3.根据权利要求1所述的三步法序贯式诱导胎肝干细胞向成熟肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤b)中的Notch信号通路抑制剂为γ-分泌酶抑制剂，且γ-分泌酶抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫辉，王涛，任丽娜，冯亚星，
申请(专利权)人：刘卫辉，
类型：发明
国别省市：四川,51