暹罗芽孢杆菌YJ15及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种暹罗芽孢杆菌YJ15及其在生物防治越橘灰霉病中的应用。本发明专利技术所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)菌株YJ15属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号CGMCC No.15952。将培养的暹罗芽孢杆菌YJ15接种于LB液体培养基中，培养制得发酵种子液，再将发酵种子液接种于发酵培养液中，以培养得到的发酵液或发酵液上清液得到生物菌剂。以本发明专利技术制备的生物菌剂防治越橘灰霉病，获得了与多菌灵效果相当的良好防效。

Bacillus siamensis YJ15 and its application

The invention relates to Bacillus siamensis YJ15 and its application in biological control of blueberry gray mould. The strain YJ15 of Bacillus siamensis belongs to Bacillus sp. and is stored in the Common Microbial Center (CGMCC) of the Chinese Committee for the Preservation and Management of Microbial Species, and the preservation number CGMCC No. 15952. The culture of Bacillus Siamensis YJ15 was inoculated in LB liquid culture medium to produce fermented seed liquid. Then the fermented seed liquid was inoculated in fermented culture medium to obtain the fermented liquid or supernatant of fermented liquid. The biological agent prepared by the invention can prevent and control blueberry grey mould, and has a good control effect comparable to carbendazim.

【技术实现步骤摘要】
暹罗芽孢杆菌YJ15及其应用
本专利技术属于微生物
，涉及农业作物病害生物防治用微生物，特别是涉及一种用于防治越橘灰霉病的暹罗芽孢杆菌。
技术介绍
越橘灰霉病由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染所致，是越橘生产中的一种重要病害。越橘灰霉病具有发病普遍、危害严重、病害扩展迅速且危害部位多等特点。尤其在设施栽培条件下，灰霉病的发生更加严重，发病率可达30%以上，对越橘的产量和果实品质造成严重影响。1924年，灰霉病首次在美国新泽西州种植的越橘上发现。目前，加拿大、韩国、智利等国家均有越橘灰霉病发生危害的报道。2012年，陈长卿等[陈长卿,张博,杨丽娜,高洁.越橘灰霉病病原菌鉴定及其生物学特性研究.吉林农业大学学报,2012.34(5):511-516.]首次在吉林农业大学越橘种植基地发现灰霉病菌，可危害果实和叶片。之后在贵州[金义兰,蒋选利,黄胜先,王正文,侯彪,李佳林.贵州省蓝莓病害种类调查与鉴定.中国果树,2015.4:80-82.]、辽宁[戴启东,李广旭,杨华,张广仁,姜树成.蓝莓采后病害的病原鉴定及发生规律研究.果树学报,2016.33(10):1299-1306.]相继发现越橘灰霉病。另外，秦士维等[秦士维,夏秀英,安利佳.蓝莓果实潜伏侵染病原真菌的分离与鉴定.北方园艺,2017.18:41-48.]研究表明，灰霉病菌也存在于健康的越橘果实中，是一种重要的潜伏侵染病原菌。化学农药是防治越橘灰霉病的有效措施，然而灰霉病菌繁殖速度快、遗传变异大、适合度高，对化学农药极易产生抗药性。与化学防治相比，生物防治方法无残留、不污染环境、病菌不易产生抗药性，是防治病害的理想方法。但目前尚未见到利用拮抗细菌防治越橘灰霉病的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株暹罗芽孢杆菌，以及该暹罗芽孢杆菌在越橘灰霉病生物防治上的应用。本专利技术从购买自山西省太原市果品市场的品种为蓝丰的贮藏期越橘果实中分离筛选内生细菌，筛选出一株编号为YJ15的灰霉病菌拮抗菌株。通过对所获得菌株进行形态特征、生理生化特性及16SrRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该菌株的培养方法、对越橘灰霉病的防效进行了深入研究，为防治越橘灰霉病提供了新的生物防治资源，为进一步利用该拮抗菌株防治越橘灰霉病奠定了基础。本专利技术所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)菌株YJ15已于2018年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。菌种保藏号CGMCCNo.15952。在NA培养基上培养本专利技术所述暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)菌株YJ15，菌落近圆形，边缘整齐，不透明，乳白色，菌落生长后期中间有褶皱。革兰氏染色为蓝紫色，为革兰氏阳性菌。透射电镜下观察，菌体为杆状，大小(1.15～1.54)μm×(0.58～0.74)μm。菌株在30～40℃可以生长；pH5.7和6.8均可生长；2～5%NaCl可生长。能产生吲哚；可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇和D-木糖；接触酶、V-P试验、葡萄糖氧化发酵、明胶液化、硝酸盐还原、丙二酸利用、卵黄卵磷脂酶、硫化氢呈阳性，运动性、水解淀粉、柠檬酸利用、甲基红、(NH4)2HPO4、脂酶、厌氧生长呈阴性。根据形态特征及生理生化试验结果，初步鉴定菌株YJ15属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)。测定出菌株YJ15的16SrRNA全序列(1451bp)，提交至GenBank数据库，获得登录号为MH118032。同源性比对结果表明：菌株YJ15与BacillussiamensisJS15E(KX129844)的相似性为100%，与BacillussiamensisJL8(KX660755)的相似性为99%。系统发育分析表明菌株YJ15与BacillussiamensisJS15E(KX129844)聚于同一分支。经上述微生物学分类与鉴定，确定本专利技术获得的菌株属于暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)。进而，本专利技术提供了所述暹罗芽孢杆菌YJ15的培养方法，是将暹罗芽孢杆菌YJ15接种于NA固体培养基上，于28℃下培养24～48h。其中，所述NA固体培养基的成分为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。更进一步地，本专利技术还提供了一种暹罗芽孢杆菌YJ15生物菌剂的制备方法，具体是将培养得到的暹罗芽孢杆菌YJ15接种于LB液体培养基中，28～32℃下摇床震荡培养15～20h，制得发酵种子液；再将所述发酵种子液接种于发酵培养液中，pH7.0～8.0条件下，28～32℃摇床震荡培养15～20h，培养所得的发酵液或发酵液的上清液即为所述生物菌剂。其中，所述发酵种子液培养用LB液体培养基的成分为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。所述发酵培养液的组成为：葡萄糖20.0g，酵母粉36.0g，FeSO41.5g，甘油1.0g，K2HPO41.5g，蒸馏水1000mL。进一步地，所述发酵培养液中发酵种子液的接种量优选为2%。本专利技术还提供了所述暹罗芽孢杆菌YJ15在用于越橘灰霉病生物防治中的应用。进而，本专利技术也提供了利用所述暹罗芽孢杆菌YJ15制备的生物菌剂在防治越橘灰霉病中的应用。本专利技术所述的应用是指对生长期的越橘作物进行喷雾处理。本专利技术从越橘果实中分离内生细菌，筛选出灰霉病菌的拮抗菌株，完成了菌株的形态及分子鉴定，优化发酵条件，并对越橘灰霉病的防效进行研究，为防治越橘灰霉病提供了新的生防资源，为进一步利用该拮抗菌株防治越橘灰霉病奠定了基础。使用本专利技术暹罗芽孢杆菌YJ15或其生物菌剂防治越橘灰霉病，不仅获得了良好的防治效果，并且对越橘果实无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。附图说明图1是暹罗芽孢杆菌YJ15对灰葡萄孢的拮抗作用，A：对照；B：YJ15菌株。图2是暹罗芽孢杆菌YJ15的菌体形态特征，A：正常视野下；B：光学显微镜下；C：透射电镜下。图3是基于16SrRNA构建的暹罗芽孢杆菌YJ15的系统发育树图。具体实施方式下述实施例仅为本专利技术的优选技术方案，并不用于对本专利技术进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。以下给出本专利技术实施例中使用到的各种培养基的具体组成。牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。LB液体培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂16g，蒸馏水1000ml。发酵培养液：葡萄糖20.0g，酵母粉36.0g，FeSO41.5g，甘油1.0g，K2HPO41.5g，蒸馏水1000mL。若未特别指明，实施例中所使用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：暹罗芽孢杆菌YJ15的分离及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)菌株YJ15，保藏号：CGMCC No.15952。

【技术特征摘要】
1.一株暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)菌株YJ15，保藏号：CGMCCNo.15952。2.一种暹罗芽孢杆菌YJ15的培养方法，是将暹罗芽孢杆菌YJ15接种于NA固体培养基上，于28℃下培养24～48h。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征是所述NA固体培养基的成分为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂粉15g，pH7.0。4.权利要求1所述暹罗芽孢杆菌在生物防治越橘灰霉病中的应用。5.一种防治越橘灰霉病的生物菌剂，所述菌剂中含有保藏号为CGMCCNo.15952的暹罗芽孢杆菌菌株YJ15。6.一种防治越橘灰霉病的生物菌剂，是保藏号为CGMCCNo.15952的暹罗芽孢杆菌菌株YJ15的发酵液或发酵液的上清液。7.权利要求6所述防治越橘...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春伟，王燕，张曦倩，刘倩如，侯普兴，王建明，张作刚，王美琴，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14