一种鸽新城疫病毒快速检测试剂盒及应用制造技术

技术编号：40928318 阅读：3 留言：0更新日期：2024-04-18 14:50

本发明专利技术公开了一种基于RT‑RAA和CRISPR/Cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒及应用。该试剂盒包含重组聚合酶扩增RT‑RAA体系和CRISPR/Cas12a体系，其中，RT‑RAA体系中靶标DNA序列的RAA引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；CRISPR/Cas12a体系中的crRNA扩增引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该体系检测敏感性高、特异性好、操作简单、检测时间短而且不需要复杂的仪器设备，适用于鸽新城疫病毒的快速、精准检测，可为鸽新城疫病毒流行病学的调查及鸽新城疫的有效防控提供重要技术支撑。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒快速检测，具体涉及一种基于rt-raa和crispr/cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒及应用。

技术介绍

1、鸽i型副黏病毒(pigeonparamyxoviruses type 1，ppmv-1)又称鸽新城疫病毒，常引起鸽新城疫，是危害养鸽业的重要病原之一。ppmv-1是新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)在适应鸽群后产生的抗原变异株，系统发育分析表明ppmv-1毒株存在遗传多样性，具有多个基因亚型。它能引起包括野鸽、家养鸽等鸟类发生感染，是危害鸽养殖业的重要疫病病原之一。ppmv-1可通过空气、污染物、排泄物等进行传播，鸽群四季均可发生感染，春冬季节发病率较高。ppmv-1有明显的宿主限制性，目前该毒株仅能从鸽群或野鸟中分离到，鸽群感染ppmv-1发病率和死亡率通常超过50％，幼鸽发病率和死亡率高于成年鸽，严重影响鸽产业的发展。因此，建立快速、精准的ppmv-1检测方法，对于鸽新城疫的防控具有重要意义。

2、crispr/cas技术是近年来备受欢迎的基因编辑技术，目前已在小鼠、大肠杆菌和水稻等生物的基因组编辑研究中广泛应用。其中cas12a蛋白(cpf1)通过crrna与dna结合释放非特异性单链dna酶活性，可用于核酸快速检测。重组酶介导的扩增技术(recombinase-aid amplification，raa)是使用了重组酶、单链dna结合蛋白以及dna聚合酶等多种酶在恒定温度下协同扩增的技术，可以实现高效的核酸扩增。侧向流层析试纸条(lateral

3、目前针对新城疫的实验室诊断方法主要分为免疫学诊断和分子生物学诊断两大类，现有检测方法各有优势，但仍依赖于大型仪器设备和专业操作人员，极大地限制了其应用范围，因此急需开发出一种快速检测鸽新城疫病毒的产品和检测方法。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是提供一种用于鸽新城疫病毒的快速检测试剂盒及其应用，检测快速、准确，为鸽新城疫病毒流行病学的调查及鸽新城疫的有效防控提供重要技术支撑。

2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种基于rt-raa和crispr/cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒，该检测试剂盒包含rt-raa体系和crispr/cas12a体系；

3、其中，rt-raa体系包含基于靶标dna序列的raa引物对，该raa引物对的核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示；crispr/cas12a体系包含核苷酸序列如seq id no.8所示的crrna。

4、进一步地，上述的靶标dna序列，其核苷酸序列如seq id no.7所示。

5、进一步地，上述crrna的扩增引物，其核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。

6、进一步地，上述crispr/cas12a体系还包括cas12a蛋白、ssdna报告探针和/或无核酸酶水；

7、其中，上述的ssdna报告探针为5’-f-ttattatt-q-3’，f为荧光素，q为荧光淬灭剂。

8、进一步地，上述crispr/cas12a体系包含2μl的1μm cas12a、1μl的100ng/μlcrrna、2μl的buffer、1μl的50u rnasin inhibitor、13μl的rnase-free ddh2o和1μl的1μmssdna。

9、本专利技术提供的检测试剂盒可用于以下任意一项中，包含鸽新城疫病毒检测、鸽新城疫病毒流行病学调查或/和鸽新城疫的防控。

10、本专利技术提供的用于鸽新城疫病毒的检测试剂盒，具有以下优点：

11、1.raa-crispr-cas12a检测鸽新城疫病毒检测限低至102拷贝/μl，具有较高的灵敏性。

12、2.raa-crispr-cas12a检测鸽新城疫病毒具有良好的特异性。该方法不与其他禽呼吸道病原禽流感病毒(aiv)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)发生反应，具有很高的特异性。

13、3.raa-crispr-cas12a检测时间短。检测鸽新城疫病毒总花费时间为50分钟，可以满足快速、特异性的核酸检测需求。

14、4.不需要荧光定量pcr仪、pcr等贵重实验设备，恒温水浴条件下即可完成。

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【技术保护点】

1.一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包含RT-RAA体系和CRISPR/Cas12a体系；

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的靶标DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述crRNA的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告探针和/或无核酸酶水；

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a体系包含2μL的1μM Cas12a、1μL的100ng/μL crRNA、2μL的Buffer、1μL的50U RNasin Inhibitor、13μL的RNase-free ddH2O和1μL的1μM ssDNA。

6.如权利要求1～5中任意一项所述的检测试剂盒在以下任意一项中的应用，包含：

...

【技术特征摘要】

1.一种基于rt-raa和crispr/cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包含rt-raa体系和crispr/cas12a体系；

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的靶标dna序列，其核苷酸序列如seq id no.7所示。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述crrna的扩增引物，其核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁立滨，李俊平，王豆，武星辰，高诗敏，郭艳娜，杨勃，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人