一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法技术

本发明专利技术属于发酵工程技术领域，特别涉及一株高产β‑半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌及其液体发酵技术。所述凝结芽孢杆菌具体为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)突变株BR‑171，保藏号为CGMCC No.14413。该菌株能够稳定、高效产β‑半乳糖苷酶，通过50L发酵罐液体深层发酵，同时经补料发酵培养84h，产酶可达4000u/ml以上。所述菌株生产的β‑半乳糖苷酶最适反应pH为5.0，在β‑半乳糖苷酶pH2.5～8.5范围内仍具有80％以上的活力，该酶的pH耐受性范围适合大部分乳制品；β‑半乳糖苷酶最适作用温度为60℃，在65℃下保温2h后剩余酶活仍达到88.4％，具有显著的耐热性；在乳制品行业具有较高的工业价值。

A Bacillus coagulans strain and its liquid fermentation method for producing enzymes

The invention belongs to the field of fermentation engineering technology, in particular to a strain of Bacillus coagulans with high production of beta galactosidase and its liquid fermentation technology. The Bacillus coagulans mutant BR 171 and its preservation number is CGMCC No. 14413. The strain can produce beta galactosidase stably and efficiently. It can produce more than 4000 u/ml by submerged fermentation in 50L fermentor and fermentation for 84h. The optimum reaction pH of the beta galactosidase produced by the strain is 5.0, and it still has more than 80% activity in the range of beta galactosidase pH 2.5-8.5. The pH tolerance range of the enzyme is suitable for most dairy products. The optimum reaction temperature of beta galactosidase is 60 (?) C, and the remaining enzyme activity still reaches 88.4% after holding for 2 hours at 65 (?) C, which has remarkable heat resistance. High industrial value.

【技术实现步骤摘要】
一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法
：本专利技术属于发酵工程
，特别涉及一株高产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌及其液体发酵技术。
技术介绍
：凝结芽孢杆(Bacilluscoagulans)，革兰氏阳性菌，属于硬(或厚)壁菌门。凝结芽孢杆菌分类学上属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，端生芽孢，无鞭毛，分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可以生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能够降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.238)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，常用名为乳糖酶，该酶能催化半乳糖苷键水解，水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，牛奶中绝大多数糖类是乳糖，但乳糖只有被β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖后才能被机体小肠粘膜细胞吸收。β-半乳糖苷酶广泛应用于乳制品行业。在奶类和乳制品加工过程中，加入安全的β-半乳糖苷酶，使其消化为葡萄糖和半乳糖，这样的奶类被称作低乳糖奶。低乳糖奶不仅可以满足正常消费者的需要，更可以满足乳糖不耐症者、先天性β-半乳糖苷酶缺乏者食用乳制品、充分吸收乳制品营养的需要。β-半乳糖苷酶来源广泛，目前已经商品化的β-半乳糖苷酶主要来源于微生物，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、脆壁酵母(Saccharomycesfragilis)等。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的乳酸菌，具有快速水解乳糖发酵产酸的特性。目前天然产酶菌株所产的β-半乳糖苷酶的酶活普遍较低，优良天然菌株资源匮乏，因此选育出新型高产酶优良菌株具有重要意义。
技术实现思路
：为了解决上述问题，本文中将提供具有很好的耐热性的诱变菌株，同时改进了发酵工艺，提高产β-半乳糖苷酶的酶活，对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。针对目前的天然产酶菌株所产β-半乳糖苷酶的酶活普遍较低，优良的天然菌株匮乏的现状，本专利技术的目的在于提供一种高产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌菌株。本专利技术还提供上述产β-半乳糖苷酶的菌株的应用及其液体发酵方法。本专利技术提供的高产β-半乳糖苷酶的菌株具体为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)BR-171。该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.14413。所述菌株由从土壤中经筛选分离并经室温常压等离子体诱变筛选获得，具有产β-半乳糖苷酶效率高，稳定性好的特性。所述菌株经液体深层通气发酵β-半乳糖苷酶的发酵液酶活力在4000U/mL以上。所述菌株生产的β-半乳糖苷酶最适反应pH为5.0，在β-半乳糖苷酶pH2.5-8.5范围内保藏1h仍具有80％以上的活力，该酶的pH耐受性范围适合大部分乳制品；β-半乳糖苷酶最适作用温度为60℃，在65℃下保温2h后剩余酶活仍达到88.4％，具有显著的耐热性；在乳制品行业具有较高的工业价值。本专利技术还提供一种以上述凝结芽孢杆菌为生产菌株制备β-半乳糖苷酶的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：(1)一级种子培养：将凝结芽孢杆菌突变菌株BR-171斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入3000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量800毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；(4)一级种子罐培养：将三级种子以3.5％接种量接入总容积为50L的一级种子罐，培养基装量30L，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V)1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10％接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V)1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；(6)发酵控制条件：溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15-30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.0-7.2；补料控制：当发酵液中的还原糖含量至5mg/mL-8mg/mL时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/mL-5mg/mL；放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。(7)所述β-半乳糖苷酶的提取与精制方法如下：向上述发酵液中加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1％20#硅藻土进行精滤；用超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(2％盐)、防腐剂(3‰苯甲酸钠，1.5‰山梨酸钾)，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-半乳糖苷酶成品酶制剂。所述一级、二级、三级种子培养的培养基组成为(质量体积百分比)：乳糖3％，酵母粉0.5％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.6％，磷酸氢二钾0.8％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌30min。所述种子罐培养的培养基基组成为(质量体积百分比)：乳糖3％，酵母粉0.8％，麦芽糊精15％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。所述发酵罐培养的培养基组成为(质量体积百分比)：乳糖3％，酵母粉1.0％，玉米粉15％，豆饼粉3.0％，玉米浆1％，氯化钙0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，柠檬酸钠0.5％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。所述补料培养基组成为(质量体积百分比)：乳糖1％，麦芽糊精50％，豆饼水解液3.0％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。所述发酵培养的培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.5，121-123℃灭菌35min备用。所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5-7均匀混合，然后加入豆饼质量5-7％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应65min，降至室温，既得豆饼水解液。有益效果：本专利技术提供了一种适于工业化生产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌菌株，并优化了相应的发酵机制。该发酵机制，过程操作简便，培养条件温和，发酵酶活力平均在4000U/mL以上，降低了单位酶活的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产β‑半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌具体为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BR‑171，保藏号为CGMCC No.14413。

【技术特征摘要】
1.一种高产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌具体为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)BR-171，保藏号为CGMCCNo.14413。2.如权利要求1所述凝结芽孢杆菌，其特征在于，采用BR-171发酵生产β-半乳糖苷酶的方法具体如下：(1)一级种子罐培养：将种子液以3.5％接种量接入一级种子罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；(2)发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10％接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量1:1-3,罐压0.05MPa,溶解氧15-30％，pH7.0-7.2；培养时间70-100h；补料控制：当发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，郭庆文，王克芬，张杰，钱娟娟，郭庆亮，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37