一种固定化乳酸菌的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种固定化乳酸菌的制备方法及应用，该制备方法包括如下步骤：S1、配制乳酸菌浓缩液：将富集培养后的乳酸菌混悬液离心浓缩得到乳酸菌浓缩液；S2、乳酸菌固定：1)用水溶胀丝胶蛋白，得到丝胶蛋白溶液，将丝胶蛋白溶液与乳酸菌浓缩液混合均匀，得到液体A；2)向所述步骤1)得到的液体A滴入交联剂，得到含有乳酸菌的丝胶蛋白水凝胶；3)纤维素粉末溶于水得到溶胀的纤维素溶液，向所述步骤2)得到的丝胶蛋白水凝胶中加入经溶胀的纤维素溶液，混匀后交联；4)将步骤3)得到的交联液通过恒流泵慢慢滴入氯化钙溶液，然后过滤，去离子水洗涤，得固定化乳酸菌，4℃冰箱保存。本发明专利技术固定化的乳酸菌用于发酵制备γ‑氨基丁酸。

Preparation and application of immobilized lactic acid bacteria

The invention discloses a preparation method and application of immobilized lactic acid bacteria. The preparation method comprises the following steps: S1, preparation of concentrated lactic acid bacteria solution: centrifugal concentration of concentrated and cultured suspension of lactic acid bacteria to obtain concentrated lactic acid bacteria solution; S2, immobilization of lactic acid bacteria: 1) water swelling sericin protein solution to obtain sericin protein solution, and evenly mixing Sericin Solution with concentrated lactic acid bacteria solution. The liquid A is obtained by dropping the crosslinking agent into the liquid A obtained in step 1, and the sericin hydrogel containing lactic acid bacteria is obtained; 3) the cellulose powder is dissolved in water to obtain the swelling cellulose solution, and the swelling cellulose solution is added into the sericin hydrogel obtained in step 2, and then the swelling cellulose solution is mixed and crosslinked; 4) the crosslinking solution obtained in step 3 is slowly dripped into chlorination through a constant flow pump. Calcium solution was then filtered and washed with deionized water. Lactic acid bacteria were immobilized and stored in refrigerator at 4 C. The immobilized lactic acid bacteria of the invention is used for fermentation to prepare gamma aminobutyric acid.

【技术实现步骤摘要】
一种固定化乳酸菌的制备方法及应用
本专利技术属于固定化乳酸菌制备
，具体涉及一种固定化乳酸菌的制备方法及应用。
技术介绍
γ-氨基丁酸(GABA)，又名氨酪酸，是一种白色结晶性粉末，广泛分布于动植物体内的非蛋白氨基酸，是中枢神经系统主要的抑制性神经递质。它在丁酸的γ位上有一个氨基，以非结合态存在，极易溶于水，微溶于热乙醇，不易溶于醇、醚和酚，具有类似于谷氨酸的甜昧，能够增强食品的风味。其分子式为C4H9NO2，分子量为103.12。GABA可抑制中枢神经系统过度兴奋，对脑部具有安定作用，进而促进放松和消除神经紧张，具有重要的生理功能：(1)改善记忆，增强记忆功能；(2)对成长荷尔蒙分泌的促进效果，成长荷尔蒙有促进骨骼肌肉的增强，提高免疫力，减少脂肪，改善机体机能等作用；(3)镇痛、镇静和改善睡眠作用；(4)对高血压有缓解和治疗作用。γ-氨基丁酸制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种，化学合成方法主要是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在强烈条件下(180℃)反应，产物与浓硫酸回流水解，再经过结晶提纯而得到。化学合成GABA虽然反应迅速，但是具有反应条件剧烈、复试性强、能耗大、成本高、副反应多以及环境污染严重等缺点。相比较而言生物合成法较安全，成本也低。生物合成法主要是利用生物体的谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase，GAD)催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐的α-羧基发生脱羧反应，从而生成GABA。其产品具有成本低、含量高及可安全用于食品的优点，但高效的微生物菌种通常较难获得。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种、戊糖片球菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、大肠杆菌细胞转化法制备GABA的报道。但是由于游离细胞不易回收重复使用，因此仍需要不断重复培养高GAD活力的细胞用于生产，而通过固定化技术将细胞固定或包埋于固态载体上，即制备成固定化细胞，则可克服游离细胞的缺点，并可实现连续化生产。赵景联等在文摘(生物工程学报，1989,5(2)：124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998,13(4)：433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA。杨胜远等在中国专利(专利号200910114016.4)中公开了将乳酸乳球菌细胞采用海藻酸钠进行固定化，通过固定化细胞技术转化谷氨酸或谷氨酸钠生产GABA。焦阳、汪建敏和杨胜远等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)中以唾液链球菌嗜热亚种Y-2为供试菌，考察了卡拉胶、明胶和海藻酸钙等材料将此菌株固定化的效果，并通过比较固定化细胞的GAD活性及γ-氨基丁酸的产量和载体机械强度，确定了海藻酸钙作为固定化细胞的适宜载体。CN201010167058.7提供了海藻酸钠固定植物软杆菌制备GABA的方法。这些方法中均采用海藻酸钠，但其抗微生物分解性能差，机械强度较低，同时海藻酸钠在高浓度的磷酸缓冲液的反复冲击下，会变软、粘连。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种固定化乳酸菌的制备方法及应用，该方法制备得到的固定化乳酸菌生物相容性好、安全无毒、活力高、负载量大、催化反应寿命长。本专利技术的另一目的是提供固定化乳酸菌在制备γ-氨基丁酸中的应用本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种固定化乳酸菌的制备方法及应用，制备方法包括以下步骤：S1、配制乳酸菌浓缩液：将富集培养后的乳酸菌混悬液离心浓缩，得到细菌数为1×108～1×109CFU/ml的乳酸菌浓缩液；S2、乳酸菌固定：1)用超纯水溶解丝胶蛋白，得到丝胶蛋白溶液，将丝胶蛋白溶液与步骤S1制备得到的乳酸菌浓缩液混合均匀，得到液体A；2)向所述步骤1)得到的液体A滴入交联剂，充分混匀后在10-40℃下，交联1h-20h，得到含有乳酸菌的丝胶蛋白水凝胶；3)纤维素粉末溶于水得到溶胀的纤维素溶液，向所述步骤2)得到的丝胶蛋白水凝胶中加入经溶胀的纤维素溶液，混匀后在20～40℃搅拌条件下交联1～30h，用纱布滤出固定化颗粒；4)将步骤3)得到的交联液通过恒流泵慢慢滴入质量百分浓度为1-3％的氯化钙溶液中，在20-40℃温度反应1-4h，然后过滤，去离子水洗涤，得到固定化乳酸菌，4℃冰箱保存。作为优选的，所述步骤1)中丝胶蛋白溶液的质量百分浓度为1-3％。作为优选的，所述步骤2)中的交联剂为含多醛基的葡聚糖的溶液。作为优选的，所述步骤2)中的交联剂的质量百分浓度为20-25％。作为优选的，所述步骤3)中的纤维素为醋酸纤维素或羧甲基纤维素或DEAE纤维素。作为优选的，所述步骤3)中的纤维素的浓度为1-3％。作为优选的，所述步骤S2中乳酸菌浓缩液、丝胶蛋白溶液、纤维素溶液和含多醛基的氧化葡聚糖溶液的体积比为1～5:1～20：1～20:2～20。作为优选的，所述步骤S2中乳酸菌浓缩液、丝胶蛋白溶液、纤维素溶液和含多醛基的氧化葡聚糖溶液的体积比为2:4：3：3。作为优选的，所述步骤2)中温度为30℃，时间为5h；所述步骤3)中温度为36℃，时间为10h。一种根据上述所述制备得到的乳酸菌在发酵制备γ-氨基丁酸中的应用。含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得：称取葡聚糖(优选T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得氧化葡聚糖。丝胶蛋白是蚕丝绸工业的副产品，作为一种生物相容性好、细胞粘附好、无毒、无污染、无刺激、可生物降解的天然蛋白质，现在被广泛应用于生物医疗领域和化妆品领域，其富含氨基、羧基等活性基团。本专利技术的含乳酸菌的丝胶蛋白水溶液在交联剂(含多醛基的葡聚糖)的作用下交联成胶。其形成的水凝胶不仅具有多孔性，可降解性性，还具有良好的生物相容性，可以搭载多种细胞并支持细胞粘附和增殖；此外具有良好的机械性能(丝胶水凝胶具有比广泛用于组织工程的海藻酸盐水凝胶更优异的机械性能)。葡聚糖本身拥有无毒、水溶性好、价格低廉的特点，也是一种经典的用于生物医用材料的原料。含多醛基的氧化葡聚糖是天然葡聚糖经高碘酸钠氧化后得到的一种高分子葡萄糖聚合物，将其用作交联剂，可以提供稳定交联，且生物相容性极好，不会引起细胞的钙化和毒性反应。纤维素属于一种工人安全的多糖，不但是植物体最主要的组成部分，而且也是微生物细胞外大分子物质的代表。纤维素的添加助于提高材料的溶胀性能，能使材料进一步硬化，增强材料的机械性能。纤维素具有超细三维网状多孔结构，可以将乳酸菌、丝胶蛋白均匀吸附并牢牢结合到其表面和内部，此外，纤维素具有更好的机械性能、优异的生物可降解性和热稳定性。氧化葡聚糖含有的多个醛基分别与纤维素中高反应活性的羟基和丝胶蛋白中的氨基进行半缩醛和席夫碱反应，将丝胶蛋白接枝导纤维素大分子上，形成具有三维网状结构的固定化乳酸菌。实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、配制乳酸菌浓缩液：将富集培养后的乳酸菌混悬液离心浓缩，得到细菌数为1×108～1×109CFU/ml的乳酸菌浓缩液；S2、乳酸菌固定：1)用水溶胀丝胶蛋白，得到丝胶蛋白溶液，将丝胶蛋白溶液与步骤S1制备得到的乳酸菌浓缩液混合均匀，得到液体A；2)向所述步骤1)得到的液体A滴入交联剂，充分混匀后在10‑40℃搅拌条件下交联1h‑20h，得到含有乳酸菌的丝胶蛋白水凝胶；3)纤维素粉末溶于水得到溶胀的纤维素溶液，向所述步骤2)得到的丝胶蛋白水凝胶中加入经溶胀的纤维素溶液，混匀后在20～40℃搅拌条件下交联1～30h；4)将步骤3)得到的交联液通过恒流泵慢慢滴入质量百分浓度为1‑3％的氯化钙溶液中，在20‑40℃温度反应1‑4h，然后过滤，去离子水洗涤，得固定化乳酸菌，4℃冰箱保存。

【技术特征摘要】
1.一种固定化乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、配制乳酸菌浓缩液：将富集培养后的乳酸菌混悬液离心浓缩，得到细菌数为1×108～1×109CFU/ml的乳酸菌浓缩液；S2、乳酸菌固定：1)用水溶胀丝胶蛋白，得到丝胶蛋白溶液，将丝胶蛋白溶液与步骤S1制备得到的乳酸菌浓缩液混合均匀，得到液体A；2)向所述步骤1)得到的液体A滴入交联剂，充分混匀后在10-40℃搅拌条件下交联1h-20h，得到含有乳酸菌的丝胶蛋白水凝胶；3)纤维素粉末溶于水得到溶胀的纤维素溶液，向所述步骤2)得到的丝胶蛋白水凝胶中加入经溶胀的纤维素溶液，混匀后在20～40℃搅拌条件下交联1～30h；4)将步骤3)得到的交联液通过恒流泵慢慢滴入质量百分浓度为1-3％的氯化钙溶液中，在20-40℃温度反应1-4h，然后过滤，去离子水洗涤，得固定化乳酸菌，4℃冰箱保存。2.根据权利要求1所述的固定化乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的丝胶蛋白溶液的质量百分浓度为1-3％。3.根据权利要求1所述的固定化乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的交...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士旺，方理明，龚金炎，肖功年，楼坚，柳永，鲍文娜，楚秉泉，张亚青，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33