一种固定化石油降解菌的制备方法及基于该固定化石油降解菌处理石油污染物的方法技术

本发明专利技术提出一种固定化石油降解菌的制备方法及基于该固定化石油降解菌处理石油污染物的方法。包括以下步骤：步骤一：制备固定化载体：取农业废弃物经破碎处理后，过筛得到粒径2～5mm的固定化载体，取固定化载体浸泡于乙醇和水的混合溶液中，取出后将所述固定化载体清洗并浸泡于蒸馏水中，除去杂质，清洗后烘干；步骤二：制备固定化石油降解菌。本发明专利技术采用农业废弃物，优选秸秆或木屑作为载体，不仅可以使农业废弃物得到有效利用，而且通过研究发现农业废弃物释放出的氮和磷营养元素可以供石油降解菌生存，提高生物活性，增加富集生物量，从而提高降解率。

A method for the preparation of immobilized fossil oil degrading bacteria and the method for the treatment of petroleum pollutants based on the immobilized oil degrading bacteria

The invention provides a method for the preparation of a immobilized fossil oil degrading bacteria and a method based on the immobilized oil degrading bacteria for the treatment of petroleum pollutants. Comprises the following steps: preparation of immobilized carrier: agricultural waste crushing treatment, sieving grain immobilized diameter 2 ~ 5mm, the mixed solution of immobilized carrier immersion in ethanol and water, after the removal of the immobilized carrier cleaning and soaked in distilled water to remove the impurity, drying after cleaning; step two: preparation of immobilized oil degrading bacteria. The invention adopts the optimization of agricultural wastes, straw or sawdust as the carrier, not only can make effective use of agricultural wastes and agricultural wastes, through research found that the release of nitrogen and phosphorus can improve survival for oil degrading bacteria, biological activity, increasing the enrichment of biomass, thus improving the degradation rate.

【技术实现步骤摘要】
一种固定化石油降解菌的制备方法及基于该固定化石油降解菌处理石油污染物的方法本专利技术属于石油污染治理
，尤其涉及一种固定化石油降解菌的制备方法及基于该固定化石油降解菌处理石油污染物的方法。
技术介绍
随着海洋溢油、运输泄漏、石油及产品离岸排放等事故逐年增多，对近海海域生态环境产生了巨大破坏。修复受石油污染海域的生态环境成为急需解决的环境和社会问题。如何实现石油污染海域的生态恢复成为当前关注的重点之一。虽然目前国内外在生物修复石油污染海域的生态修复已有较为成熟的研究，但在实际污染治理事件中仍然无法得到应用，究其原因有：(一)在海洋环境中，由于波浪和潮汐的作用导致微生物无法富集，单位空间上的生物量很少；(二)、海洋中营养物质不足，致使微生物无法正常地生存繁殖，生物活性降低，从而降解率大大降低；(三)、生态修复后代谢产物对海洋环境产生未知的影响及菌群群落发生变化。因此，如何通过提高生物量、生物活性等来修复实际海域污染具有重要的指导意义。已知本领域技术中采用固定化微生物法修复石油污染海水，可以提高单位被污染水域内的微生物量，加强生物修复技术的效果，达到修复石油污染海域的生态效果。目前，从提高生物量角度，主要是采用固定化技术。然而固定化生物修复技术更多的是在研究无机固定化载体，利用无机载体多孔隙的结构富集微生物，吸附石油，增大石油和微生物的接触面积，进而提高石油降解率。然而无机固定化载体因不能提供足够的营养物质(如：氮、磷)，导致其降解率不高。例如中国专利CN106520750A公开了一种固定化微生物溢油修复剂及其制备方法。该修复剂以海藻酸钠-CaCl2-生物基活性碳为载体包埋微生物制成，包埋的微生物的浓度为8×108-6×109cell/g。制备方法为：将生物基活性碳与微生物种子液混合进行吸附，形成混合悬浊液；在混合悬浊液中加入30～40℃的已灭菌的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液加入到CaCl2溶液中分散成球，交联12h～24h，得到固定化微生物。又例如中国专利CN105695445A公开了一种用于含油污水处理的固定化微生物，该固定化材料包括海藻酸钠、CaCl2、纳米二氧化硅以及低聚木糖，包埋的微生物的浓度为3～4×109cell/g。该固定化微生物菌剂的制备方法：将培养后的石油降解菌液3000rpm下离心4-5min，去除上层清液，收集底部浓缩菌液，用无菌水将其调节至OD600为1；将一定量的海藻酸钠、纳米二氧化硅以及低聚木糖加入上述浓缩菌液中，混合均匀，用注射器吸取混合液，逐滴滴入到3.5～4.0％CaCl2溶液中，得固定化微球，交联12～14h后，用无菌水清洗固定化菌剂。但上述方法中，采用的包埋法制备工艺较复杂，制备过程不易控制；包埋环境导致微生物活性低；包埋材料较昂贵，限制了大范围的应用。从而导致在固定化微生物菌剂处理石油污染物时，降解率较低，处理效果较差。
技术实现思路
本专利技术针对上述的的技术问题，提出一种固定化石油降解菌的制备方法及基于该固定化石油降解菌处理石油污染物的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种固定化石油降解菌的制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备固定化载体：取农业废弃物经破碎处理后，过筛得到粒径2～5mm的固定化载体，取固定化载体浸泡于乙醇和水的混合溶液中，取出后将所述固定化载体清洗并浸泡于蒸馏水中，除去杂质，清洗后烘干；步骤二：制备固定化石油降解菌：取海水水样，对其中的石油降解菌进行富集、分离、纯化和筛选后得到石油降解菌；取所述固定化载体置于固定化培养基中，所述固定化培养基的pH值为7.2～7.5，经灭菌处理，加入所述石油降解菌，所述固定化培养基内石油降解菌的浓度为4×107cfu/mL～6×107cfu/mL，经固定化2～5天后取出得到固定化石油降解菌。作为优选，所述固定化培养基包括1000mL蒸馏水、10～13g蛋白胨、4～4.5g牛肉膏、l5～20gNaCl、1～3mL浓度为1.11g/L的CaCl2、1～3mL浓度为1.52g/L的FeSO4、2～5mL浓度为3.60g/L的MgSO4和1～5mL柴油，调节所述固定化培养基的pH至7.2～7.5。作为优选，所述固定化培养基中固定化载体的添加量为：每50mL固定化培养基添加0.2～0.5g固定化载体。作为优选，所述乙醇和水的体积比为(2：1)～(3：1)；所述固定化载体在乙醇和水的混合溶液中的浸泡时长为1～2h。作为优选，所述石油降解菌的富集方法包括以下步骤：取富集培养基，加入海水水样，添加1～10mL柴油，经恒温培养5～7天后，取出液体，置于新的富集培养基中，重复操作3～5次，获取得到石油降解菌富集培养基；其中所述富集培养基包括：1L蒸馏水、2～4g酵母膏、0.6gNa2HPO4、0.5gKH2PO4、3gNH4NO3、1～3mL浓度为1.11g/L的CaCl2、1～3mL浓度为1.52g/L的FeSO4、2～5mL浓度为3.60g/L的MgSO4和30gNaCl；调节所述富集培养基的pH至7.2～7.5。作为优选，所述石油降解菌的分离、纯化方法包括以下步骤：取所述石油降解菌富集培养基经高压灭菌锅于121℃灭菌20min，取出30～50mL倒入培养皿中，待冷却凝固，经培养后得到培养液，取培养液稀释105～109倍，划于培养皿中进行恒温培养，得到分离的多个菌落，分别挑选单个菌落用接种环稀释106倍，划于新的盛有石油降解菌富集培养基的培养皿上，经培养后观察所述培养皿，如所述培养皿含有两种以上形态的菌落，再将不同形态的菌落继续平板划线，进行培养，重复上述步骤，直至每个培养皿均仅含有一种单一菌株。作为优选，将经分离、纯化的每一株石油降解菌置于富集培养基内培养富集后，取菌液加入经灭菌处理后的海水，所述菌液占海水的体积分数为1％～3％，按照每升海水加入5～10mL柴油的量添加所述柴油，选取柴油降解率在60％以上的石油降解菌。作为优选，所述的农业废弃物为秸秆或木屑。作为优选，所述石油降解菌包括食烷菌、假单胞菌、食单胞菌和甲基杆菌中的一种或几种。作为优选，所述固定化石油降解菌的制备方法，具体包括以下步骤：步骤一：制备固定化载体：取秸秆或木屑经破碎处理后，过6目筛，得到粒径为3mm的固定化载体，取固定化载体浸泡于体积比为(2：1)～(3：1)的乙醇和水的混合溶液中，浸泡1～2h，取出后将所述固定化载体清洗并浸泡于蒸馏水中，浸泡2～3h，再用蒸馏水除去杂质，清洗2～3遍，于60℃条件下烘干24h；步骤二：制备石油降解菌：取富集培养基，加入海水水样，添加1～10mL柴油，于30℃、160r/min的恒温培养箱里培养5～7d，取出10mL液体，置于新的富集培养基中，重复操作3～5次，直到富集到足够量的石油降解菌为止；其中所述富集培养基包括：1L蒸馏水、2～4g酵母膏、0.6gNa2HPO4、0.5gKH2PO4、3gNH4NO3、1～3mL浓度为1.11g/L的CaCl2、1～3mL浓度为1.52g/L的FeSO4、2～5mL浓度为3.60g/L的MgSO4和30gNaCl；调节所述富集培养基的pH至7.2～7.5；取所述石油降解菌富集培养基经高压灭菌锅于121℃灭菌20min，取出30～50mL倒入培养皿中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化石油降解菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：制备固定化载体：取农业废弃物经破碎处理后，过筛得到粒径2～5mm的固定化载体，取固定化载体浸泡于乙醇和水的混合溶液中，取出后将所述固定化载体清洗并浸泡于蒸馏水中，除去杂质，清洗后烘干；步骤二：制备固定化石油降解菌：取海水水样，对其中的石油降解菌进行富集、分离、纯化和筛选后得到石油降解菌；取所述固定化载体置于固定化培养基中，所述固定化培养基的pH值为7.2～7.5，经灭菌处理，加入所述石油降解菌，所述固定化培养基内石油降解菌的浓度为4×10

【技术特征摘要】
1.一种固定化石油降解菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：制备固定化载体：取农业废弃物经破碎处理后，过筛得到粒径2～5mm的固定化载体，取固定化载体浸泡于乙醇和水的混合溶液中，取出后将所述固定化载体清洗并浸泡于蒸馏水中，除去杂质，清洗后烘干；步骤二：制备固定化石油降解菌：取海水水样，对其中的石油降解菌进行富集、分离、纯化和筛选后得到石油降解菌；取所述固定化载体置于固定化培养基中，所述固定化培养基的pH值为7.2～7.5，经灭菌处理，加入所述石油降解菌，所述固定化培养基内石油降解菌的浓度为4×107cfu/mL～6×107cfu/mL，经固定化2～5天后取出得到固定化石油降解菌。2.根据权利要求1所述的固定化石油降解菌的制备方法，其特征在于，所述固定化培养基包括1000mL蒸馏水、10～13g蛋白胨、4～4.5g牛肉膏、l5～20gNaCl、1～3mL浓度为1.11g/L的CaCl2、1～3mL浓度为1.52g/L的FeSO4、2～5mL浓度为3.60g/L的MgSO4和1～5mL柴油，调节所述固定化培养基的pH至7.2～7.5。3.根据权利要求1所述的固定化石油降解菌的制备方法，其特征在于，所述固定化培养基中固定化载体的添加量为：每50mL固定化培养基添加0.2～0.5g固定化载体。4.根据权利要求1所述的固定化石油降解菌的制备方法，其特征在于，所述乙醇和水的体积比为(2：1)～(3：1)；所述固定化载体在乙醇和水的混合溶液中的浸泡时长为1～2h。5.根据权利要求1所述的固定化石油降解菌的制备方法，其特征在于，所述石油降解菌的富集方法包括以下步骤：取富集培养基，加入海水水样，添加1～10mL柴油，经恒温培养5～7天后，取出液体，置于新的富集培养基中，重复操作3～5次，获取得到石油降解...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛建良，史可，刘志秀，吴亚男，高宇，肖新峰，徐化春，许萌，
申请(专利权)人：山东科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37