一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法，目的在于提供一种强度大，易回收的生物基质材料用于固定化脂肪酶的制备方法。所采取的技术方案是:以纤维素为原料，采用反相悬浮技术以及共沉淀法制备出磁性纤维素微球，利用硅烷化改性技术，引入强度较大的Si‑O键，制备出强度较大的硅烷化磁性纤维素微球，最后采用交联—共价键法将游离脂肪酶固定在材料上，得到一种硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂。该方法所使用的原料来源广、无污染，制备的硅烷化磁性微球较其他磁性纤维素微球强度大、重复使用次数高，能广泛应用于能源、医药和化工等领域。

A method for immobilizing lipase by magnetic cellulose microspheres with silane

The present invention relates to a method for immobilizing lipase with a silane magnetic cellulose microsphere, so as to provide a biological matrix material with high strength and easy recovery, and is used for the preparation of immobilized lipase. The technical scheme is: using cellulose as raw material by inverse suspension technique and were prepared by magnetic cellulose microspheres modified by silane, introducing a strong Si O key, prepared greater strength of silanized magnetic cellulose microspheres, the free lipase immobilized on material by crosslinking - covalent method, a silane immobilized lipase catalyst magnetic cellulose microspheres. The method uses a wide source of raw materials, no pollution, silanized magnetic microspheres with other magnetic cellulose microspheres of high strength, high number of repeated use, can be widely used in energy, medicine and chemical industry.

【技术实现步骤摘要】
一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法
本专利技术涉及一种以硅烷化磁性纤维素微球为载体，用于固定脂肪酶，从而获得新型固定化脂肪酶催化剂的方法，属于固定化酶生物制备工艺

技术介绍
酶是活细胞体内产生的具有高度专一化性和催化活性的蛋白质，被称为生物催化剂。脂肪酶是其重要的组成部分，主要用于催化酯水解、醇水解、酯合成、酯交换等反应，但直接利用脂肪酶进行反应会遇到一系列问题：(1)易溶于水，难以分收再利用，导致高成本；(2)酶在非水溶剂中不溶解，反应过程中易聚集降低酶的利用率；(3)不稳定，易受外界因素变化而失活。因为游离酶在催化反应中存在以上的问题，使其使用受到一定的限制，为了解决这个问题，固定化酶的逐渐受到广泛关注。固定化酶可以像一般化学反应的固定化催化剂一样，既具有酶的催化特性，又能回收、反复利用，达到绿色环保功能。固定化酶的方法主要是包埋法、吸附法和共价连接法，包埋法是把酶定位于包埋材料的格子结构或微囊结构中，方法简便，生物活性被破坏的程度低，但其不适于大分子反应；吸附法是通过物理吸附或离子吸附，利用酶的侧链基团和载体间的相互作用力达到酶固定化的方法，条件温和，操作简单，然而酶和载体间连接不够牢固，易脱落；因此目前常用的是采用共价连接方法，将酶蛋白分子上功能基和载体表面上的反应基团之间形成化学共价键，其结合力强，不易脱落，稳定性好。研究发现酶蛋白分子上含有的氨基、羧基、酚基、巯基等基团可以与经戊二醛活化过的载体反应生成共价键。目前载体来源主要是无机材料、天然高分子材料、新型材料，无机材料做载体主要是氧化铝、二氧化硅、膨润土等，主要是通过物理吸附与酶结合，由于其颗粒粒度大、孔径及比表面积小，在固定化酶领域的应用也受到很大限制。纤维素是自然界中广泛存在、可再生的一种天然高分子材料，具有价廉、可降解、无污染等特点，目前已经被制备成各种类型的材料，如薄膜、微球、纤维状等。其结构含有大量的羟基存在，为了达到结构多样化的目的，可以利用氨基、羧基等官能团对纤维素表面的羟基其进行一系列的改性从而使纤维素表面生成不同的官能团用于负载不同种类的物质，使其应用广泛，目前已用于药物固载、固定化酶制备等方面，但其强度较低稳定性不高，易被分解，因此本专利技术拟采用硅烷化试剂向纤维素微球表面引入Si-O键以增加材料强度，得到一种硅烷化磁性纤维素微球用于制备固定化酶催化剂，具有硬度大，回收率高，活性好的特点。
技术实现思路
本专利技术以纤维素为原料，采用反相悬浮技术以及共沉淀法制备出磁性纤维素微球，利用硅烷化改性技术，引入强度较大的Si-O键，制备出强度较大的硅烷化磁性纤维素微球，最后采用交联—共价键法将游离脂肪酶固定在材料上，得到一种硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂本专利技术通过以下方案实现的：a.反相悬浮技术制备磁性纤维素微球：利用碱化作用破除纤维素材料的氢键，再进行老化、磺化过程降低分子聚合度，生成可溶性的纤维素粘胶液，以碳酸钙为制孔剂，与纤维素胶粘液搅匀后加入分散相中，利用反相悬浮技术分散成液滴，同时升温固化成球形，并利用碳酸钙和盐酸发生的复分解反应对纤维素微球制孔；采用共沉淀法将Fe3+和Fe2+在碱性条件下沉积于微球表面，形成磁性纤维素微球。b.硅烷化技术改性纤维素微球：将得到的磁性纤维素微球置于硅烷化溶剂中，加入硅烷化试剂，一定温度下搅拌，可得硅烷化磁性纤维素微球。c.交联—共价键法固载脂肪酶：以戊二醛为交联剂，活化磁性硅烷化纤维素微球载体上的氨基，将活化后的载体与酶液混合，使载体上的氨基与脂肪酶分子表面的氨基酸残基发生化学反应形成共价键，制得硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂。按照一种硅烷化磁性纤维素小球固定脂肪酶的方法，其特征在于步骤a中的纤维素材料为脱脂棉、棉麻纤维、微晶纤维素、玻璃纤维中的一种或几种；按照一种硅烷化磁性纤维素小球固定脂肪酶的方法，其特征在于步骤b中所采用的硅烷化试剂为APTES，溶剂为异丙醇与水的混合物，硅烷化时间为4～8h；按照一种硅烷化磁性纤维素小球固定脂肪酶的方法，其特征在于步骤c中所描述的固载条件为：每克纤维素微球加入18～20mL25％戊二醛水溶液，350～400μL酶液，pH值为6～8,固载时间是4～8h；另一方面，本专利技术中制备的一种硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂具有催化活性，其特征在于在转酯化、酯化及水解反应中的催化作用。附图说明图1为扫描能谱图：A.未硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶能谱图；B.硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶能谱图；C.未硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶扫描电镜图；D.硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶扫描电镜图。图2为本专利技术制备硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶各个过程的红外扫描图：a.磁性纤维素微球；b.硅烷化磁性纤维素微球；c.经戊二醛活化后的硅烷化磁性纤维素微球；d.硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶。图3为热重分析TG-DGA曲线：A.硅烷化磁性纤维素微球TG-DGA曲线；B.未硅烷化磁性纤维素微球TG-DGA曲线。具体实施方式实施例1磁性纤维素微球的制备：称取5g脱脂棉，用19％碱液浸泡2h，抽滤后将脱脂棉室温下放置老化48h,加入5mlCS2磺化10h,加适量6％碱液和碳酸钙搅拌均匀，倒入400～600mL含有0.05～0.1g油酸钾、0.2～0.4gspan60的变压器油中，室温搅拌0.5～2h，利用反相悬浮技术分散成液滴，然后升温至80～90℃固化成球形，搅拌结束后将油倒出，用大量热水和乙醇洗涤微球，用乙醇浸泡一段时间后向其中加入稀盐酸溶液，利用碳酸钙和盐酸发生的复分解反应对纤维素微球制孔；将得到的多孔纤维素微球加入到150mL含有Fe3+和Fe2+的混合液中，室温下抽真空1h,加入氨水调节pH值,在强碱性条件下进行热共沉淀制得磁性纤维素微球。实施例2硅烷化磁性纤维素微球的制备：称取1g制得的磁性纤维素微球，加入到异丙醇和水的混合溶液中(150mL异丙醇+15mL水),加入120μL在30℃下进摇床，反应7h后将磁性微球用磁铁分离出来，用乙醇洗涤五次后室温干燥得到硅烷化磁性纤维素微球。实施例3硅烷化磁性纤维素微球固定化脂肪酶的制备：称取1g硅烷化磁性纤维素微球，加入到80mL含有3～10％戊二醛溶液的磷酸缓冲溶液中，搅拌1.5～2h，加入稀释后的酶液，放入25～35℃的摇床固酶4～8h，制得以硅烷化磁性纤维素微球为载体的固定化脂肪酶催化剂。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法，具有以下的制备过程和步骤：a.反相悬浮技术制备磁性纤维素微球：利用碱化作用破除纤维素材料的氢键，再通过老化、磺化过程降低分子聚合度，生成可溶性的纤维素粘胶液，以碳酸钙为制孔剂，与纤维素胶粘液搅匀后加入分散相中，利用反相悬浮技术分散成液滴，同时升温固化成球形，并利用碳酸钙和盐酸发生的复分解反应对纤维素微球制孔；采用共沉淀法将Fe

【技术特征摘要】
1.一种硅烷化磁性纤维素微球固定脂肪酶的方法，具有以下的制备过程和步骤：a.反相悬浮技术制备磁性纤维素微球：利用碱化作用破除纤维素材料的氢键，再通过老化、磺化过程降低分子聚合度，生成可溶性的纤维素粘胶液，以碳酸钙为制孔剂，与纤维素胶粘液搅匀后加入分散相中，利用反相悬浮技术分散成液滴，同时升温固化成球形，并利用碳酸钙和盐酸发生的复分解反应对纤维素微球制孔；采用共沉淀法将Fe3+和Fe2+在碱性条件下沉积于微球表面，形成磁性纤维素微球；b.硅烷化技术改性纤维素微球：将已制得的磁性纤维素微球置于硅烷化溶剂中，加入硅烷化试剂，利用硅烷化改性技术制得硅烷化磁性纤维素微球；c.交联-共价键法固定脂肪酶：以戊二醛为交联剂，活化磁性硅烷化纤维素微球载体上的氨基，将活化后的载体与酶液混合，使载体上的氨基与脂肪酶分子表面的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：付玉杰，洪丽，韩盈枝，王希清，姚丽萍，王微，赵春建，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23