以CEA为靶点的嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种以CEA为靶点的嵌合抗原受体。所述的嵌合抗原受体由N端到C端顺次包括抗原结合区、IL‑10R1胞外域、IL‑15Rβ链、共刺激结构域以及T细胞信号传导区功能结构域。

Chimeric antigen receptors targeting CEA

The invention relates to the field of biomedicine, in particular to a chimeric antigen receptor targeting CEA. The chimeric antigen receptor consists of antigen binding region, extracellular domain of IL_10R1, chain of IL_15Rbeta, costimulatory domain and functional domain of T cell signal transduction region in sequence from N to C terminal.

【技术实现步骤摘要】
以CEA为靶点的嵌合抗原受体
本专利技术涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种以CEA为靶点的嵌合抗原受体。
技术介绍
CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。这种新的治疗策略的关键之处在于识别靶细胞的被称作嵌合抗原受体(CAR)的人工受体，而且在经过基因修饰后，病人T细胞能够表达这种CAR。在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞，然后在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，这样这些T细胞就能够表达这种新的受体。这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。这些T细胞利用它们表达的CAR受体结合到靶细胞表面上的分子，而这种结合触发一种内部信号产生，接着这种内部信号如此强效地激活这些T细胞以至于它们快速地摧毁靶细胞。近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，具有更广阔的应用空间。癌胚抗原(CarcinoembryonicAntigen，CEA)又称CEACAM-5或CD66e，是一种重要的肿瘤相关抗原。在人体上皮细胞恶性肿瘤、90％的胃肠道肿瘤、胰腺癌、80％以上的非小细胞肺癌和50％左右的乳腺癌中，都有CEA的高表达，即上述肿瘤呈CEA阳性。但由于CEA的抗原性很弱，不能有效地激活机体的特异性免疫反应，使得肿瘤细胞能够逃避免疫杀伤，导致这类肿瘤患者的死亡率较高。到目前为止，现有技术中在检测治疗CEA靶点的CAR-T技术方面仍然很少，CAR在提升与CEA靶点结合的灵敏度、特异性，以及更好地激活T细胞方面还有很大的技术空间。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术涉及一种以CEA为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、IL-10R1胞外域、IL-15Rβ链、共刺激结构域以及T细胞信号传导区功能结构域；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3的序列依次如SEQIDNO:1～3所示，轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3的序列依次如SEQIDNO:4～6所示。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、与传统肿瘤治疗方法相比，该方法副作用小。2、IL-15受体由α链、β链和γ链组成，其中β链和γ链与IL-2共用；将IL-10R1胞外域与IL-15Rβ链组成嵌合受体，CAR-T达到病灶后，会接触肿瘤微环境中的IL-10，继而会使IL-2/IL-15促炎信号通路得以激活，提高CAR-T的杀伤效果和持久力。3.抗原结合区具有很高的活性，且能够避免CA125配体对CEA靶点结合的影响。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中将CEA-CAR片段和CEA-CAR-control片段转染T细胞制备得到的CAR-T细胞进行体外杀伤对比；ANOVA，*p＜0.05，vsT细胞组；图2为本专利技术一个实施例中CAR-T细胞的体内验证；two-wayANOVA，*p＜0.05，vsPBS。具体实施方式本专利技术涉及一种以CEA为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、IL-10R1胞外域、IL-15Rβ链、共刺激结构域以及T细胞信号传导区功能结构域；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3的序列依次如SEQIDNO:1～3所示，轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3的序列依次如SEQIDNO:4～6所示。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述IL-10R1胞外域的序列如SEQIDNO:7所示。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述IL-15Rβ链的序列如SEQIDNO:8所示。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述共刺激结构域选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合；优选为CD28。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述抗原结合区选自人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；或上述抗体类型的具有抗原结合活性的功能片段。优选的，所述抗原结合区的重链骨架区序列依次如SEQIDNO:9～12所示，轻链骨架区序列依次如SEQIDNO:13～16所示；优选的，所述抗原结合区选自scFv；scFV由VI和VH连接得到，所用连接肽(linker)的序列为(GGGGS)3。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述T细胞信号传导区功能结构域选自PKCθ、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ或其任意组合；优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD3ζ。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的嵌合抗原受体。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子；优选的，所述载体为逆转录载体，更优选为慢病毒。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化；优选的，所述宿主细胞为T细胞、NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种制备CAR修饰的细胞的方法，所述方法包括：将如上所述的核酸分子、或如上所述的载体导入待修饰的细胞内，从而获得所述CAR修饰的细胞；优选的，所述CAR修饰的细胞为T细胞、NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及如上所述的载体、或如上所述的细胞。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及如上所述的载体、或如上所述的细胞在制备用于治疗CEA阳性实体瘤的治疗剂中的应用；优选的，所述CEA阳性实体瘤包括肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、直结肠癌、甲状腺癌、尿道癌、卵巢癌、胆管细胞癌、前列腺癌、支气管癌、唾液腺癌、小肠癌、大肠癌、胆管癌、胰管癌、尿道癌。下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1sc-Fv的制备1.动物免疫与单克隆抗体的制备以人CEA蛋白的胞外结构域部分多肽片段作为免疫原，与弗氏完全佐剂混合，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠(免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以CEA为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、IL‑10R1胞外域、IL‑15Rβ链、共刺激结构域以及T细胞信号传导区功能结构域；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR‑VH1、CDR‑VH2、CDR‑VH3的序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，轻链互补决定区CDR‑VL1、CDR‑VL2、CDR‑VL3的序列依次如SEQ ID NO:4～6所示。

【技术特征摘要】
1.一种以CEA为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、IL-10R1胞外域、IL-15Rβ链、共刺激结构域以及T细胞信号传导区功能结构域；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3的序列依次如SEQIDNO:1～3所示，轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3的序列依次如SEQIDNO:4～6所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述IL-10R1胞外域的序列如SEQIDNO:7所示；优选的，所述IL-15Rβ链的序列如SEQIDNO:8所示。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激结构域选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合；优选为CD28；优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自PKCθ、ZAP70或CD3ζ或其任意组合；优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD3ζ。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合区选自人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；或上述抗体类型的具有抗原结合活性的功能片段；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭磊，
申请(专利权)人：杭州普略生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33