靶向Mesothelin的嵌合抗原受体并联合表达抗PD1抗体的方法及其用途技术

本发明专利技术涉及靶向Mesothelin‑aPD1的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗Meso单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区和抗人PD1单链抗体的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明专利技术还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明专利技术制备的Mesothelin‑aPD1 CAR‑T细胞对特异性肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，本发明专利技术制备的CAR‑T细胞还能分泌抗PD1抗体具有调节免疫抑制微环境的作用。

Method and Application of Targeting Chimeric Antigen Receptor of Mesothelin and Jointly Expressing Anti-PD1 Antibody

The present invention relates to chimeric antigen receptors targeting Mesothelin_aPD1 and their applications. Specifically, the present invention provides a polynucleotide sequence selected from: (1) the coding sequence containing sequentially linked anti-Meso single chain antibodies, the coding sequence of human CD8alpha hinge region, the coding sequence of human CD8 transmembrane region, the coding sequence of human 41BB intracellular region and anti-human PD1 single chain antibody; and (2) (1) the complementary sequence of the polynucleotide sequence. The invention also provides the relevant fusion protein, the carrier containing the coding sequence, and the use of the fusion protein, the coding sequence and the carrier. The Mesothelin_aPD1 CAR_T cells prepared by the present invention have strong killing effect on specific tumor cells, and the CAR_T cells prepared by the present invention can secrete anti-PD1 antibodies, which can regulate the immunosuppressive microenvironment.

【技术实现步骤摘要】
靶向Mesothelin的嵌合抗原受体并联合表达抗PD1抗体的方法及其用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向Mesothelin(SS1)-CD28-BBz-aPD1的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
胰腺癌(PancreaticCarcinoma)是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，多见于50岁以上的人群。其发病率有明显的地区差异，近年来发病率呈逐渐上升趋势，在欧美国家已是第4位常见的恶性肿瘤，居消化道癌症死因的第2位，仅次于大肠癌,其发病隐匿，早期症状无特异性，手术切除率低。在肿瘤发生发展的进程中，很多基因的活化及其产物的表达起到了重要的作用，其内在确切的分子机制尚不完全明确，随着现代影像及内镜技术的飞速发展，对一些症状体征及影像表现较为明显的胰腺癌，明确诊断己没有太大困难，但此时大多己失去最佳手术时机，而对于一些早期患者诊断较难。因此寻求新的治疗手段，对于胰腺癌的治疗是当务之急。在肿瘤的浸润转移过程的研究方面，间皮素(Mesothelin)也是当前研究的热点。1996年Chang等利用宫颈癌HeLa细胞克隆出单克隆抗体识别的抗原，研究发现该抗原存在于正常间皮细胞，故命名为Mesothelin。肿瘤患者术后生存率低预后差的主要原因与它的浸润转移有关，肿瘤的浸润转移机制研究是目前的热点和难点。Mesothelin基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工形成一个40kDa的膜结合蛋白(即Mesothelin)和一个3lkDa称之为巨核细胞促进因子MPF的脱落片断。间皮素高表达于多种肿瘤组织中，卵巢癌患者血清中的MesothelinmRNA和蛋白质水平高表达，组织切片染色显示非粘蛋白卵巢癌中有66％呈间皮素阳性；在胸膜间皮瘤的检测中发现，15例确诊为上皮性间皮瘤的病例全都呈阳性，4例肉瘤性间皮瘤全为阴性；Argani等研究报道，切除的原发性胰腺癌中，免疫组化法检测表明60例有54例强阳性，而周围正常胰腺组织则无Mesothelin反应活性；在其他实体肿瘤分析中，官颈、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌冰冻切片中均可发现间皮素免疫活性，肺腺癌、子宫内膜癌、交界性滑膜肉瘤及结缔组织增生性小圆细胞肿瘤有少量间皮素表达，在乳腺癌，甲状腺癌、肾细胞癌、膀胱移细胞癌、黑色素癌及肝癌中仅有少许或没有Mesothelin表达。Mesothelin的生物学功能尚未明确。Pastan等构建了一种Mesothelin基因突变小鼠，这些基因突变小鼠与同胞的野生型小鼠生长和繁殖相同，并且二者的血小板计数没有统计学差异；有研究显示Mesothelin与CA125结合能介导细胞粘附，由此研究者们也认为CA125和Mesothelin在卵巢癌的转移扩散中可能起重要作用；另外，有研究亦表明，Mesothelin基因的表达受到Wnt等重要信号途径的调节，如在卵巢癌和胰腺癌中，Wnt信号转导途径持续激活促使Mesothelin表达增加。虽然。Mesothelin的功能及其致癌作用仍有待于进一步明确，但其在正常组织中的分布有限而在某些肿瘤组织高度表达的特征，因而Mesothelin可作为肿瘤特异性抗体治疗的靶向。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。目前在ClinicalTrials.gov注册的抗MesothelinCAR-T细胞治疗临床试验有10项，主要针对胰腺癌、卵巢癌、胸膜瘤、肺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤。在宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究中，病人都是在接受过一线治疗后病情进一步发展，并且肿瘤组织表达Mesothelin，他们接受了瞬转CARmRNA的T细胞治疗。这种Mesothelin特异性的二代CAR具有CD3ξ和4-1BB共刺激因子结构域。这些Mesothelin特异性的CART存活期短，在两位病人中表现出了抗肿瘤作用，可见Mesothelin能够作为CART细胞识别的抗原，并且瞬转mRNA的方式也是可行的。另一项宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究使用的是慢病毒转染的Mesothelin特异性CAR。这项开始于2014年7月的研究是针对耐化疗的恶性胰腺癌、上皮性卵巢癌和恶性上皮胸膜间皮瘤。在6位病人的早期研究结果中，4位病人在CART细胞输注28天后病情稳定。CART细胞输注没有引起急性副反应，并且相比mRNA瞬转，慢病毒转染构建的CART细胞的持续性得到提升。PD1(programmeddeath1)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡1受体。PD1受体表达于T细胞表面和初级B细胞表面，在这些细胞的分化和凋亡中发挥作用。PD1有两个配体，分别是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，属于B7家族蛋白(Blood.2009.114(8):p.1537-44.)。PD-L1蛋白广泛表达于抗原提呈细胞、活化T、B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。PD-L1与T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。正常情况下，机体遇到外来病原体或抗原侵犯时，抗原提呈细胞捕获抗原，对抗原进行加工使之成为T细胞可以识别的抗原表位，与MHC分子结合并呈现与细胞外侧供T细胞识别。T细胞通过TCR与抗原提呈细胞的MHC分子结合，另外共刺激信号CD28受体与初始T细胞表面的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合，T细胞接到正向调控信号，初始T细胞活化为效应T细胞，启动免疫应答。当有持续抗原刺激时，为避免应答过度，活化T细胞表面表达PD1，与抗原提呈细胞表面的PD-L1结合，向T细胞传递负向调控信号，T细胞增殖减少或凋亡。研究发现，在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上PD-L1的表达，表达的PD-L1和T细胞表面的PD1结合抑制T细胞抗肿瘤活性，从而使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和清除，有利于肿瘤的发生和生长。PD1/PD-L1通路抑制剂可以阻断PD1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。PD1/PDL1通路抑制剂主要包括anti-PD1或anti-PD-L1单抗。2014年7月，施贵宝的Opdivo率先在日本获批用于治疗晚期黑色素瘤，成为全球首个批准上市的PD1抑制剂。这是PD1抑制剂首次在III期临床实验中显示生存期疗效，其和化疗药达卡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：(1)含有依次连接的抗Mesothelin单链抗体的编码氨基酸序列、人CD8α铰链区的编码氨基酸序列、人CD8跨膜区的编码氨基酸序列、人CD28胞内区的编码氨基酸序列、人41BB胞内区的编码氨基酸序列、人CD3ζ胞内区编码氨基酸序列、和抗人PD1单链抗体的编码氨基酸序列；和(2)(1)所述氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：(1)含有依次连接的抗Mesothelin单链抗体的编码氨基酸序列、人CD8α铰链区的编码氨基酸序列、人CD8跨膜区的编码氨基酸序列、人CD28胞内区的编码氨基酸序列、人41BB胞内区的编码氨基酸序列、人CD3ζ胞内区编码氨基酸序列、和抗人PD1单链抗体的编码氨基酸序列；和(2)(1)所述氨基酸序列。2.如权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列在所述抗Mesothelin单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1第1-22位氨基酸所示；和/或所述抗Mesothelin单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第23-128位氨基酸所示；和/或所述抗Mesothelin单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第141-259位氨基酸所示；和/或所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第260-306位氨基酸所示；和/或所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第307-328位氨基酸所示；和/或所述人CD28胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第329-369位氨基酸所示；和/或所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第370-417位氨基酸所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第418-528位氨基酸所示；和/或所述P2A氨基酸序列如SEQIDNO:1第529-554位氨基酸所示；和/或所述人IL-2信号肽氨基酸序列如SEQIDNO:1第555-574位氨基酸所示；和/或所述抗PD1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第575-687位氨基酸所示；和/或所述抗PD1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1第703-809位氨基酸所示。3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，在所述抗Mesothelin单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:2第1-66位核苷酸序列所示；和/或所述抗Mesothelin单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第67-384位核苷酸序列所示；和/或所述抗Mesothelin单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第421-777位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:2第778-918位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQIDNO:2第919-984位核苷酸序列所示；和/或所述人CD28胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第985-1107位核苷酸序列所示；和/或所述人41BB胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第1108-1251位核苷酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第1252-1584位核苷酸序列所示；和/或所述人P2A的编码序列如SEQIDNO:2第1585-1662位核苷酸序列所示；和/或所述人IL-2信号肽的编码序列如SEQIDNO:2第1663-1722位核苷酸序列所示；和/或所述抗PD1单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第1723-2061位核苷酸序列所示；和/或所述抗PD1单链抗体的轻链可变区的编码序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31