嵌合因子VIII多肽及其用途制造技术

本发明专利技术提供包含VWF的D’结构域和D3结构域的VWF片段、包含所述VWF片段和异源部分的嵌合蛋白或包含所述VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白及其使用方法。包含本发明专利技术的VWF片段的多肽链结合包含FVIII蛋白的多肽链或与之缔合，并且包含所述VWF片段的所述多肽链可阻止或抑制内源性VWF与所述FVIII蛋白的结合。通过阻止或抑制作为FVIII的半衰期限制因子的内源性VWF与所述FVIII的结合，所述VWF片段可诱导所述FVIII蛋白的半衰期延长。本发明专利技术还包括核苷酸、载体、宿主细胞、使用所述VWF片段或所述嵌合蛋白的方法。

Chimeric factor VIII polypeptide and its application

The present invention provides VWF fragments containing the D'domain and D3 domain of VWF, chimeric proteins containing the VWF fragments and heterologous parts, or chimeric proteins containing the VWF fragments and FVIII proteins, and methods for their use. The polypeptide chain containing the VWF fragment of the present invention binds or associates with the polypeptide chain containing the FVIII protein, and the polypeptide chain containing the VWF fragment can prevent or inhibit the binding of the endogenous VWF with the FVIII protein. By blocking or inhibiting the binding of endogenous VWF as a half-life limiting factor of FVIII to the FVIII, the VWF fragment can induce the half-life extension of the FVIII protein. The invention also includes nucleotides, vectors, host cells, methods for using the VWF fragment or the chimeric protein.

【技术实现步骤摘要】
嵌合因子VIII多肽及其用途本申请是申请日为2013年1月12日、中国专利申请号为201380013452.7(国际申请号为PCT/US2013/021330)、专利技术名称为“嵌合因子VIII多肽及其用途”的专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景凝血是血液形成凝块的复杂过程。它是止血即阻止受损血管的失血的重要部分，其中受损血管壁被含血小板和血纤维蛋白的凝块覆盖，以终止流血并开始修复受损血管。凝血障碍可导致出血(溢血)或阻塞性凝血(血栓形成)的风险增加。凝血几乎在血管损伤破坏血管的内皮细胞内衬后的瞬间开始。血液暴露于蛋白质例如组织因子引发了血小板和血浆蛋白凝血因子血纤维蛋白原的变化。血小板立即在损伤部位形成血塞；这称为初期止血。二期止血与此同时进行：血浆中称为凝血因子或凝固因子的蛋白质在复杂的级联反应中响应，形成增强血小板栓的血纤维蛋白链。非限制性凝血因子包括但不限于：因子I(血纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V(促凝血球蛋白原、不稳定因子)、因子VII(稳定因子、前转变素)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B或克雷司马斯因子(Christmasfactor))、因子X(斯图亚特因子(Stuart-Prowerfactor))、因子XI(血浆促凝血酶原激酶先质)、因子XII(接触因子(Hagemanfactor))、因子XIII(血纤维蛋白稳定因子)、VWF、前激肽释放酶(弗莱彻因子(Flectcherfactor))、高分子量激肽原(HMWK)(菲茨杰拉德因子)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、血纤维蛋白溶酶原、α2-抗血纤维蛋白溶酶、组织血纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)和血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)。甲型血友病是编码凝血因子VIII(FVIII)的基因缺陷导致的出血性病症，并且在10,000例出生男性中有1-2例受其影响。Graw等,Nat.Rev.Genet.6(6):488-501(2005)。受甲型血友病影响的患者可通过输注纯化的或重组产生的FVIII治疗。然而，所有市售FVIII产品已知具有约8-12小时的半衰期，因此需要频繁向患者静脉内施用。参见WeinerM.A.和Cairo,M.S.,PediatricHematologySecrets,Lee,M.T.,12.DisordersofCoagulation,ElsevierHealthSciences,2001；Lillicrap,D.Thromb.Res.122增刊4:S2-8(2008)。此外，为延长FVIII半衰期已尝试过多种方法。例如，在开发中延长凝血因子半衰期的方法包括聚乙二醇化、糖聚乙二醇化以及与白蛋白缀合作用。参见Dumont等,Blood.119(13):3024-3030(2012年1月13日在线发表)。然而，不考虑所用的蛋白质工程，目前正在开发的长效FVIII产品具有提高的半衰期，但据报道半衰期有限—在临床前动物模型中仅提高约1.5至2倍。出处同上。在人类中显示出一致的结果，例如，据报道在甲型血友病患者中与相比，rFVIIIFc提高半衰期最多约1.7倍。出处同上。因此，尽管提高量很小，半衰期增加可表明存在其它T1/2限制因素。参见Liu,T.等,2007ISTH会议，摘要#P-M-035；Henrik,A.等,2011ISTH会议，摘要#P＝MO-181；Liu,T.等,2011ISTH会议，摘要#P-WE-131。血浆血管性血友病因子(VWF)具有大约12小时(在9至15小时的范围内)的半衰期。http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm(最近访问2011年10月22日)。VWF半衰期可受到多种因素的影响：糖基化模式、ADAMTS-13(具有血小板反应蛋白基序-13的解聚素和金属蛋白酶)以及VWF中的各种突变。在血浆中，95-98％的FVIII在具有全长VWF的紧密非共价复合物中循环。该复合物的形成对于在体内维持适当的FVIII血浆水平是重要的。Lenting等,Blood.92(11):3983-96(1998)；Lenting等,J.Thromb.Haemost.5(7):1353-60(2007)。全长野生型FVIII主要以具有重链(MW200kd)和轻链(MW73kd)的异源二聚体存在。当FVIII由于重链第372和740位和轻链第1689位的蛋白水解而活化时，结合到FVIII的VWF从活化的FVIII移除。活化的FVIII连同活化的因子IX、钙和磷脂(“因子X酶复合物(tenasecomplex)”)一起参与因子X的活化，从而生成大量凝血酶。凝血酶继而切割血纤维蛋白原，形成可溶性血纤维蛋白单体，所述可溶性血纤维蛋白单体然后自发聚合形成可溶性血纤维蛋白聚合物。凝血酶还活化因子XIII，其连同钙一起用于交联并且稳定可溶性血纤维蛋白聚合物，形成交联(不溶性)血纤维蛋白。活化的FVIII通过蛋白水解从循环迅速清除。由于频繁给药以及给药方案造成的不便，仍需要开发不需要频繁施用的FVIII产品，即半衰期长于1.5至2倍半衰期限制的FVIII产品。专利技术概述本专利技术涉及包含因子VIII("FVIII")蛋白和辅助部分("AM")的嵌合蛋白，其中所述辅助部分抑制或阻止内源性VWF结合所述FVIII蛋白。所述FVIII蛋白和所述辅助部分通过共价键彼此连接，以阻止在内源性VWF存在下所述辅助部分的解离。在一个实施方案中，所述共价键是肽键、二硫键或连接基(linker)，其强度足以阻止在内源性VWF存在下所述辅助部分从所述FVIII蛋白解离。在另一个实施方案中，所述辅助部分阻止所述FVIII蛋白通过VWF清除途径被清除。在其它实施方案中，所述辅助部分通过屏蔽或阻断所述FVIII蛋白上的VWF结合位点抑制或阻止内源性VWF结合所述FVIII蛋白。例如，VWF结合位点位于所述FVIII蛋白的所述A3结构域或所述C2结构域或所述A3结构域和所述C2结构域二者。在一些实施方案中，所述嵌合蛋白包括包含通过共价键彼此连接的FVIII蛋白和辅助部分的构建体，其中所述嵌合蛋白不包括引起所述FVIII蛋白的半衰期限制的FVIII半衰期限制因子，如全长VWF蛋白或成熟VWF蛋白。因此，在一些实施方案中，在内源性VWF存在下，所述嵌合蛋白的所述FVIII蛋白的所述半衰期可延长超过所述FVIII蛋白的所述半衰期限制。在某些实施方案中，所述辅助部分具有至少一种VWF样FVIII保护特性。所述VWF样FVIII保护特性的实例包括但不限于：保护所述FVIII蛋白不被一种或多种蛋白酶切割、保护所述FVIII蛋白不被活化、稳定所述FVIII蛋白的所述重链和/或所述轻链或防止所述FVIII蛋白被一种或多种清除剂受体清除。在一个实施方案中，所述辅助部分包括多肽、非多肽部分或它们二者。在另一个实施方案中，所述辅助部分可以是包含长度为至少约40个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含通过共价键连接的因子VIII("FVIII")蛋白和辅助部分(AM)的嵌合蛋白，其中所述辅助部分抑制或阻止内源性VWF结合所述FVIII蛋白。

【技术特征摘要】
2012.01.12 US 61/586,099;2012.01.13 US 61/586,654;1.一种包含通过共价键连接的因子VIII("FVIII")蛋白和辅助部分(AM)的嵌合蛋白，其中所述辅助部分抑制或阻止内源性VWF结合所述FVIII蛋白。2.一种编码根据权利要求1所述的嵌合蛋白的多核苷酸。3.一种或多种载体，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸和一个或多个可操作地连接至所述多核苷酸或所述多核苷酸组的启动子。4.一种宿主细胞，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸或根据权利要求3所述的载体。5.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的嵌合蛋白、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的载体或根据权利要求4所述的宿主细胞以及可药用载体。6.一种阻止或抑制FVIII蛋白与内源性VWF的相互作用的方法，其包括向需要其的受试者加入有效量的根据权利要求1所述的嵌合蛋白、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的载体、根据权利要求4所述的宿主细胞或根据权利要求5所述的组合物，其中所述VWF片段抑制或阻止所述FVIII蛋白与内源性VWF的相互作用。7.一种移除或减少FVIII蛋白的半衰期限制因子的方法，其中所述方法包括加入有效量的根据权利要求1所述的嵌合蛋白、根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊克塔·赛思·切布拉，刘童瑶，罗伯特·彼得斯，江海燕，
申请(专利权)人：比奥贝拉蒂治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US