抗人PLGF单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，包括动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、细胞融合、细胞筛选、亚克隆、抗体纯化、染色体分析等步骤；本发明专利技术通过将试验过程、试验材料进行优化，使其最适于PLGF单克隆抗体的制备，所制备的PLGF单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与PLGF抗原结合力强等优点，可用于免疫组化、免疫荧光、放射自显影或其他方法来定性定位或定量检测各种疾病如肿瘤或炎症患者的组织器官中的PLGF表达水平，以辅助临床诊断，同时PLGF单克隆抗体可作为PLGF蛋白的拮抗剂药物成分，用于治疗因血管过度增生而引起的多种疾病包括各种恶性肿瘤。

Preparation of monoclonal antibodies against human PLGF

The invention discloses a preparation method of monoclonal antibodies against human PLGF, including animal immunity and preparation of spleen cells, preparation of myeloma cells, preparation of feeder cells, cell fusion, cell screening, subcloning, antibody purification, chromosome analysis, etc. The prepared PLGF monoclonal antibody has the advantages of high titer, good affinity and strong binding with PLGF antigen. It can be used for qualitative localization or quantitative detection of PLGF expression in tissues and organs of patients with various diseases such as tumors or inflammation by immunohistochemistry, immunofluorescence, autoradiography or other methods to assist clinical diagnosis. At the same time, PLGF monoclonal antibody can be used as an antagonist to PLGF protein. Pharmaceutical ingredients are used to treat various diseases, including malignant tumors, caused by vascular hyperplasia.

【技术实现步骤摘要】
抗人PLGF单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及抗人PLGF单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。VEGF是目前已知的最强烈的刺激血管内皮细胞分裂增生的因子。VEGF一般常由血管内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞所合成，并通过自分泌/旁分泌方式特异地作用于血管内皮细胞上的受体，而发挥促进血管内皮细胞生长、增殖、迁移、形成等作用。研究表明，在多数恶性肿瘤患者的癌组织中也能够检测到VEGF，且VEGF的表达水平增高与肿瘤恶性程度和疾病进展有关此外，VEGF在炎症病理的血管中起着重要的作用。PLGF与VEGF两者同源，结构与生物活性相近，且都可与VEGFR1受体结合。但以往的研究更为关注的是VEGF，而对于PLGF，尽管其编码基因早在1991年就已克隆出，但其在血管增生中的意义长时期以来一直是处于从属或未定状态。近年来随着研究的深入，越来越多的结果证明PLGF实际上参与许多生理或病理条件下的血管增生。因此，需进一步研发出一种PLGF蛋白的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA检测法检测血清中抗体效价，取效价高的小鼠免疫脾细胞；(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞融合前1天，进行细胞换液并使骨髓瘤细胞在融合当天为对数生长阶段；(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用5ml HAT培养基将饲养细胞悬浮，调整...

【技术特征摘要】
1.抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA检测法检测血清中抗体效价，取效价高的小鼠免疫脾细胞；(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞融合前1天，进行细胞换液并使骨髓瘤细胞在融合当天为对数生长阶段；(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用5mlHAT培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/mL，将饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；(4)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完毕，将融合细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；(5)细胞筛选：细胞长至孔底1/10面积时，酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，选择OD值高的杂交瘤细胞进行亚克隆；(6)亚克隆：采用软琼脂法进行杂交瘤细胞的亚克隆，阳性孔继续进行2-3次克隆化，直至100％杂交瘤细胞阳性率，最终得到高特异性PLGF杂交瘤细胞株，将高特异性PLGF杂交瘤细胞株液氮保存；(7)抗体纯化：将上述高特异性PLGF杂交瘤细胞经过滤离...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐静，张伟，催丛丛，
申请(专利权)人：宁波奥丞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33