一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，活体条件下，麦穗上的所有小花均有同等接触赤霉菌的机会而非仅接种倒3小穗的一个小花，观察籽粒荧光信号；离体条件下，籽粒对赤霉菌生长速率和产毒情况的影响，以及赤霉菌对籽粒发芽率的影响，从活体和离体两个层面综合评价小麦赤霉病的籽粒抗性。该发明专利技术的最大优点是将籽粒抗性独立于扩展抗性，解决了传统鉴定评价体系将籽粒抗性和扩展抗性混为一谈的弊端。与传统通过肉眼观察统计的籽粒感染率（FDK）作为籽粒抗性评价指标相比，该发明专利技术从量化指标综合评价了不同材料间的籽粒抗性，更有利于评价体系的准确性和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法
本专利技术属于植物抗病鉴定评价
，具体地，涉及一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法。
技术介绍
目前赤霉病籽粒抗性评价采用的主要方法是单花滴注法接种后的籽粒感染率（FDK），即在小麦扬花期对穗部的倒3小穗的单侧小花注射孢子液，标记接种时间，接种后18-21天收获，收获后进行手工脱粒，根据籽粒干瘪、皱缩、发白等症状统计发病率（感病籽粒数占总籽粒数的百分比）进行抗性评价。因此单花滴注法主要评价的是扩展抗性，而不是籽粒本身的抗性；感病籽粒症状评价多凭借肉眼观察，不同评价者的评价标准不同，尚未存在统一的评价标准；此外，存在籽粒外表正常，但内部损坏严重的现象，通过肉眼识别无法判断抗感情况。因此只能间接评价扩展抗性，但无法准确和真实的评价籽粒抗性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服单花滴注法无法区分扩展抗性和籽粒抗性的缺点，避免肉眼观察及评价标准的差异导致结果重现性差，从活体和离体角度建立一种准确且较为系统的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：在小麦扬花期进行标花，标花时利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，活体条件下，将制备好的带有绿色荧光蛋白的赤霉菌孢子液分别注射到花后5天、花后15天、花后25天麦穗的所有剩余小花，接种赤霉菌孢子液后5-7天取样，观察籽粒荧光信号强弱；离体条件下，花后10天、花后20天、花后30天及成熟期取样、脱粒，培养于加有赤霉菌菌块的培养基中，测定菌丝生长速率及DON含量，以及测定赤霉菌菌液处理后籽粒发芽率，综合评价小麦的赤霉病籽粒抗性。所述的标花是指在小麦扬花期，利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，只保留每个小穗两侧的两个小花，并在穗下节间紧靠基部小穗处贴上防水标签，标签上记载标花日期。麦穗是由小穗，穗轴和小穗轴组成，每个小穗又由3-5朵小花组成。在实验中，本专利技术去除了每个小穗的中间小花，只留下两侧的小花用于接种。去除中间小花的目的是保证接种的一致性，也有利于鉴定，中间小花易漏接，对鉴定结果产生较大影响。所有剩余小花即保留的每个小穗两侧的两个小花。所述的赤霉病孢子液注射是指利用医用注射器和注射针，将孢子液注射到麦穗所有剩余小花的内、外颖间，然后在穗下节间紧靠基部小穗处贴上防水标签，标签上记载接种日期和菌株名称。所述的接种赤霉菌孢子液后5-7天取样，具体日期根据接种后平均气温情况决定，当平均气温高于25℃，接种后5天即可取样；当平均气温低于25℃，接种后6-7天取样。籽粒荧光信号通过MVX10透射光明场观察。所述的培养基是指马铃薯琼脂糖培养基（PDA）。所述的籽粒培养于加有赤霉病菌块的培养基，具体为：籽粒在PDA培养基上呈圆形排列，从内到外分为3圈，每圈6粒，圈之间的间距为2cm，然后利用灭菌后的圆形打孔器从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上取相似位置上的菌块至培养皿中央。所述的菌丝生长速率是指将加有籽粒与菌块的培养基置于25℃培养箱中培养不同时间后测定的菌落直径。所述的发芽率是指将赤霉菌菌液处理后的籽粒置于26℃黑暗条件下培养36h萌发出芽后统计的发芽率。所述的综合评价小麦赤霉病籽粒抗性是指评价依据接种赤霉菌后籽粒荧光信号、菌丝生长速率、DON含量以及发芽率。赤霉病籽粒抗性鉴定和评价体系的主要指标有：（1）是否排除扩展抗性的影响，即独立评估籽粒抗性；（2）鉴定指标的准确性和重要性；（3）评价方法的稳定性和一致性；对比传统的以单花滴注接种后籽粒感染率（FDK）作为指标的鉴定方法与本专利技术在上述3个技术指标方面的差异，本专利技术的优势和结果为：（1）传统方法易受扩展抗性的影响，本方法将籽粒抗性独立于扩展抗性；本专利技术在对扬花后不同发育阶段穗子上的所有小花进行接种，单独评价了籽粒抗性；（2）常规评价体系只以籽粒感染率（FDK）作为籽粒抗性鉴定指标，仅从植物体角度评价较为单一；本专利技术以活体及离体两种试验方法，从植物体和病原菌作为不同切入点研究互作关系，设立荧光信号强度、菌丝生长速率、DON含量及发芽率指标全面评价籽粒抗性；(3)传统鉴定体系只通过肉眼观察籽粒干瘪、皱缩、发白等症状来统计籽粒感染率（FDK），存在人为差异，鉴定不准确；因此本专利技术对离体条件下培养基中DON积累量以及菌丝生长速率进行测定，准确评估籽粒抗性，不同材料间重现性好。附图说明图1为实施例1的NP152和NP164抗性差异示意图。具体实施方式为了阐述本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本专利技术做进一步的介绍。本专利技术的目的是通过如下措施来达到全面且准确的评价小麦赤霉病籽粒抗性，本专利技术的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法分别针对活体及离体两部分，其步骤、流程和基本特征是：活体部分：[1].从经过活化的带有绿色荧光蛋白（GFP）的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器，取3-5块菌块放入150mL经过灭菌的液体培养基，然后置于摇床上，以180rpm，温度25-28℃，摇72-120小时，取样观察产孢情况并吸取1uL孢子液，滴到血球计数板上，置于显微镜下测定孢子浓度，然后稀释或浓缩到合适的浓度。[2].在小麦扬花期进行标花，并利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花。[3].在花后5天、花后15天、花后25天利用医用注射器和注射针，等量注射步骤[1]制备的孢子液至麦穗所有剩余小花的内颖和外颖之间。[4].接种孢子液后第5-7天取样观察接种后籽粒荧光信号强弱。具体日期根据接种后平均气温情况决定，若平均气温高于25℃，接种后5天即可取样；若平均气温低于25℃，接种后6-7天取样。离体部分：1.小麦籽粒对于赤霉菌生长及产毒的影响：[1].在小麦扬花期进行标花，并利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花。[2].在花后10天、花后20天、花后30天及成熟期取样、脱粒。[3].籽粒消毒：75%酒精浸泡籽粒30s，倒掉酒精，用次氯酸钠：无菌水=1:1消毒处理40min，倒掉液体，用无菌水冲洗3次。[4].培养基制备：PDA（马铃薯琼脂糖）：无菌水=1：25加热至完全溶解，无菌操作台下倒平板，配置25ml等量PDA培养基至直径9cm的无菌培养皿中。[5].用灭菌后的镊子放置籽粒，籽粒呈圆形排列，从内到外分为3圈，每圈6粒，圈之间的间距为2cm。[6].籽粒放置完全后，利用灭菌后的圆形打孔器从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上取相似位置上的菌块至培养皿中央，然后用无菌封口膜封口后置于25℃培养箱中培养。不放置籽粒，只放置菌块的培养皿作为对照。[7].培养后36h及之后每隔24h拍照记录籽粒对于菌丝生长速度、生长形态、色泽等的影响，游标卡尺测量菌丝生长直径。并统计菌丝生长布满整个培养基所需的时间。[8].菌丝布满整个培养基时，测定培养基中的DON含量。2.赤霉菌对于小麦籽粒发芽的影响：[1].籽粒消毒：75%酒精浸泡小麦成熟籽粒30s，倒掉酒精，用次氯酸钠：无菌水=1:1消毒处理40min，倒掉液体，用无菌水冲洗3次。[2].培养皿发芽：直径9cm培养皿内铺上无菌滤纸，分别滴加赤霉菌菌液和绿豆汤溶液作为处理及对照，每个培养皿内放置16粒籽粒，26℃黑暗条件下培养36h萌发出芽，统计发芽率（以芽长超过籽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：在小麦扬花期进行标花，标花时利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，活体条件下，将制备好的带有绿色荧光蛋白的赤霉菌孢子液分别注射到花后5天、花后15天、花后25天麦穗的所有剩余小花，接种赤霉菌孢子液后5‑7天取样，观察籽粒荧光信号强弱；离体条件下，花后10天、花后20天、花后30天及成熟期取样、脱粒，培养于加有赤霉菌菌块的培养基中，测定菌丝生长速率及DON含量，以及测定赤霉菌菌液处理后籽粒发芽率，综合评价小麦的赤霉病籽粒抗性。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：在小麦扬花期进行标花，标花时利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，活体条件下，将制备好的带有绿色荧光蛋白的赤霉菌孢子液分别注射到花后5天、花后15天、花后25天麦穗的所有剩余小花，接种赤霉菌孢子液后5-7天取样，观察籽粒荧光信号强弱；离体条件下，花后10天、花后20天、花后30天及成熟期取样、脱粒，培养于加有赤霉菌菌块的培养基中，测定菌丝生长速率及DON含量，以及测定赤霉菌菌液处理后籽粒发芽率，综合评价小麦的赤霉病籽粒抗性。2.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：所述的标花是指在小麦扬花期，利用镊子去除麦穗所有小穗的中间小花，只保留每个小穗两侧的两个小花，并在穗下节间紧靠基部小穗处贴上防水标签，标签上记载标花日期。3.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：所述的赤霉病孢子液注射是指利用医用注射器和注射针，将孢子液注射到麦穗所有剩余小花的内、外颖间，然后在穗下节间紧靠基部小穗处贴上防水标签，标签上记载接种日期和菌株名称。4.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病籽粒抗性的方法，其特征是：所述的接种赤霉菌孢子液后5-7天取样，具体日期根据接种后平均气温情况决定，当平均气温高于2...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚璇，李长成，李磊，张语卉，李韬，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32