一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法。具体为：1)采集血样，获取血浆后，进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；2)：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；3)将所述标准样品进行LC‑MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。本发明专利技术所述的方法采用的一种全自动在线二维固相萃取样品前处理方式，最大程度地去除基质干扰，降低基质效应，具有富集纯化一步完成、固相萃取柱可多次使用、重现性好、测定效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法
本专利技术属于血液样本生物标记物检测领域，具体涉及一种基于在线固相萃取-液相色谱-串联质谱同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法。
技术介绍
烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草和卷烟烟气中广泛存在的一类强致癌物质，主要包括4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基降新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)。国际癌症组织(IARC)将NNK和NNN归为一级人体致癌物。在啮齿动物中，NNK可导致肺腺癌，在暴露于环境烟气中的非吸烟者中也发现同样的病症。4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)是NNK的主要代谢物，并且具有和NNK相似的致癌活性。NNAL可发生葡萄糖苷酸化生成NNAL-葡萄糖苷酸(NNAL-Gluc)解毒。NNAL和NNAL-Gluc的总量称为总NNAL，是吸烟者或烟气环境中非吸烟者暴露于NNK的理想的生物标志物。目前，已有的TSNAs的烟气接触生物标志物的研究，多为吸烟人群尿液中的研究，而人体尿液由于受饮水量等因素影响较大，虽然可采用肌酐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)待测血浆的制备：采集血样，获取血浆后，进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；2)标准样品的制备：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；3)绘制标准曲线：将所述标准样品进行LC‑MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。

【技术特征摘要】
1.一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)待测血浆的制备：采集血样，获取血浆后，进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与ResinGP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；2)标准样品的制备：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；3)绘制标准曲线：将所述标准样品进行LC-MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚硝胺至少包括NNAL、NAT、NNK、NNN和NAB。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测血浆采用如下方式获得：采集血样后，离心获得待测血浆；然后在所述待测血浆中加入β-葡萄糖醛酸酶，振荡孵育进行酶解；振荡孵育完成后加入内标，再采用超滤离心管离心处理，即可。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每1mL待测血浆中加入15000～19000units的所述β-葡萄糖醛酸酶，所述振荡孵育的时间为20～30h；优选为每1mL待测血浆中加入17000～17200units的所述β-葡萄糖醛酸酶，所述振荡孵育的时间为24h。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述二维SPE处理包括如下条件：所述PRS阳离子交换柱和ResinGP反相萃取柱均采用1.8～2.2mL甲醇，以4.8～5.2mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用1.8～2.2mL2％的甲酸，以4.8～5.2mL/min的流速进行平衡；所述ResinGP反相萃取柱采用1.8～2.2mL2％的氨水，以4.8～5.2mL/min的流速进行平衡；和/或，采用0.5～1.1mL2％的甲酸，以0.4～0.8mL/min的流速进行上样；和/或，采用0.8～1.2mL2％的氨水，以0.6～0.8mL/min的流速将所述待测血浆从PRS阳离子交换柱转移至ResinGP反相萃取柱；和/或，采用0.8～1.2mL2％的甲酸，以1.8～2.2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用0.8～1.2mL2％的氨水和0.8～1.2mL含有10％甲醇的氨水溶液对ResinGP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为1.8～2.2mL/min；和/或，进样量为：280～320μL；和/或，洗脱时间为2.3～2.7min。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二维SPE处理包括如下条件：所述PRS阳离子交换柱和ResinGP反相萃取柱均采用2mL甲醇，以5mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用1.8～2.2mL2％的甲酸，以5mL/min的流速进行平衡；所述ResinGP反相萃取柱采用2mL2％的氨水，以5mL/min的流速进行平衡；和/或，采用0.5mL2％甲酸，以0.8mL/min的流速进行上样；和/或，采用0.8mL2％的氨水，以0.8mL/min的流速；和/或，采用1mL2％的甲酸，以2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用1mL2％的氨水和1mL含有10％甲醇的氨水溶液对ResinGP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为2mL/min；和/或，进样量为：300μL；和/或，洗脱时间为2.5min。7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS分析采用WatersAltlantisT3色谱柱进行色谱分离，以8～12mmoL/L的乙酸铵水溶液为流动相A相，乙腈为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：0～4.5min：88％～20％A；4.6～5.0min：20～5％A；5.1～7.0min：5％A；7.1～...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，周骏，刘兴余，白若石，杨振东，徐同广，芦楠，张晨，
申请(专利权)人：上海烟草集团有限责任公司，上海烟草集团北京卷烟厂，
类型：发明
国别省市：上海,31