禽腺病毒4型卵黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及禽腺病毒4型卵黄抗体的制备方法，包括A)用禽腺病毒4型灭活疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，进一步获得卵黄液；B)将上述卵黄液与Tris‑HCl缓冲盐溶液混合，加入苯酚溶液，混匀，静置，低速离心，收集上清液；C)往上清液中加入终浓度为0.2～1.0(m/v)的聚乙二醇15‑羟基硬脂酸酯，搅拌混合，静置一定时间，离心，收集上清液；D)将上清液经纯化、浓缩、无菌步骤，即得。本发明专利技术提供的禽腺病毒4型卵黄抗体制备方法因为不涉及后续的凝胶层析等操作，成本低，操作简便，同时通过对提取步骤和纯化步骤的改良，使得抗体的回收率、去脂率显著高于现有方法，取得了显著的进步。

【技术实现步骤摘要】
禽腺病毒4型卵黄抗体及其制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及禽腺病毒4型卵黄抗体及其制备方法。
技术介绍
卵黄抗体(immunoglobulinofeggyolk，IgY)是禽卵黄中存在的免疫球蛋白，是由禽血液中的IgG转移至卵黄中产生的对子代具有保护性作用的抗体。IgY的分子质量约为180ku，由2条轻链和2条重链组成，其中轻链分子质量约22～30ku，重链分子质量为67～70ku，等电点接近5.2。与IgG相比，IgY具有动物种系发生学距离的优势，更适于生产特异性抗体。由于IgY具有独特的理化性质和生物学特性，用作禽宿主来产生抗特定抗原的IgY正逐渐受到学者的关注。卵黄中约含有30％的脂类(水分约占48％，蛋白质约占18％)，其中大部分脂肪与蛋白质以脂蛋白的形式存在。卵黄包括水溶性蛋白(α-卵黄球蛋白、β-卵黄球蛋白、γ-卵黄球蛋白(IgY))。而高质量的IgY，其必须纯度高，同时，抗体回收率要高。而要提取IgY首先要获得水溶性成分(watersolublefraction,WSF)，目前国内外学者已展开了广泛的研究，如现有技术CN104072609A中专利技术人向蛋黄液中加入泊洛沙姆提取WSF；如CN101717445B中专利技术人用聚乙二醇获得水溶性蛋白WSF；V.Ntakarutimana等将含有氯仿的TBS缓冲盐溶液加入到蛋黄液中提取WSF[NTAKARUTIMANAV，DEMEDTSP，VanSANDEM，etal.Asimpleandeconomicalstrategyfordownstreamprocessingofspecificantibodiestohumantransferrinfromeggyolk[J].JImmunolMethods，1992，153(1/2):133-140.]。但上述方法中卵黄抗体的回收率最高不超过80％。高质量卵黄抗体的制备另一个关键步骤在于纯化步骤。目前较为常用的纯化方法盐析法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水层析法等。其中，盐析法简单、经济，但是提取的IgY纯度低(不超过70％)，脂肪残留量高；而层析法虽然能得到高纯度的IgY(90％)，但是其产率低，且费用高，不适宜大规模应用，仅适用于科研。
技术实现思路
本专利技术旨在提供禽腺病毒4型卵黄抗体及其制备方法，该方法适用于实际生产卵黄抗体，因为其成本低，且卵黄抗体回收率最高可达96.6％，更重要的脂肪残留量低，低于1％。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：禽腺病毒4型卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：A)用禽腺病毒4型灭活疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄，进一步获得卵黄液；B)将上述卵黄液与Tris-HCl缓冲盐溶液混合，加入苯酚溶液，混匀，静置，低速离心，收集上清液；C)往上清液中加入终浓度为0.2～1.0(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，搅拌混合，静置，离心，收集上清液；D)将步骤C)得到的上清液经纯化、浓缩、无菌步骤，得到卵黄抗体。优选地，所述步骤B)中卵黄液与Tris-HCl缓冲盐按1：(3～6)的体积比混合。优选地，所述步骤B)中卵黄液与苯酚溶液按1：(1～3)的体积比混合。优选地，所述纯化步骤具体为：往上述上清液中按1:1的质量比加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解，加入终浓度0.01～1％(m/v)的CMC值为0.1～8.0mM的去污剂，混匀，静置，离心，收集沉淀，将沉淀用无菌生理盐水溶解后，经大孔树脂吸附除去去污剂，即得。优选地，所述步骤S2中加入终浓度为0.06～1％(m/v)的CMC值为0.1～8.0mM的去污剂。CMC值在上述范围内的去物质包括但不限于SDS、胆酸钠、CHAPS、脱氧胆酸钠。更优选地，所述去污剂的CMC值为0.1～3.0mM。因为CMC值在此0.1～3.0mM范围内的去污剂用于纯化，制得的卵黄抗体的纯度最高，脂肪残留量最低。更选地，所述去污剂的CMC值为1.33，当去污剂的CMC值为1.33时优选去污剂为SDS。本文中所述“CMC值”是指单体去污剂开始聚集成微团时的临界浓度，简称临界微团浓度(ctiticalmicelleconcentration,CMC)。相应地，本专利技术还提供了一种上述制备方法制备得到的禽腺病毒4型卵黄抗体。优选地，所述卵黄抗体中脂类残留量低于1％。本专利技术其中一个创新点在于在WSF提取过程中，对传统的苯酚抽提法进行了改良，采用苯酚+聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯共同提取，发现，抗体回收率是单独使用苯酚提取的1.68倍。但是此时的提取物中还含有较多的脂类，本专利技术另外一个创新点在于，采用CMC值为0.1～8.0mM的去污剂进行纯化，特别的是，当去污剂的CMC值为0.1～3.0mM时，制得的卵黄抗体的纯度最高，脂肪残留量最低，仅为0.65～1.0％，而当CMC值为1.33时，去脂率最高，脂类残留量为0.65％。而对于取得上述效果的机制，尚未明确。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的禽腺病毒4型卵黄抗体制备方法因为不涉及后续的凝胶层析等操作，成本低，操作简便，同时通过对提取步骤和纯化步骤的改良，使得抗体的回收率、去脂率显著高于现有方法，取得了显著的进步。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下实施例。本文中禽腺病毒4型灭活疫苗购自广东渔跃生物技术有限公司，其中，每0.1ml禽腺4型病毒液含量≥108.5TCID50。实施例1、禽腺病毒4型卵黄抗体制备A)皮下注射2ml禽腺病毒4型灭活疫苗免疫100日龄蛋鸡，共免疫3次，间隔免疫时间为21d，在最后一次免疫后5d收集鸡蛋，获得高免鸡蛋；B)将高免鸡蛋用无菌生理盐水清洗，晾干，接着用95％酒精喷洒消毒，晾干，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，获得卵黄液；C)将上述卵黄液与pH7.2的Tris-HCl缓冲盐溶液按1：5的体积比混合，按卵黄液：苯酚＝1:2的体积比加入苯酚溶液，充分搅拌，混匀，静置30min，低速离心，收集上清液；D)往上清液中加入终浓度为0.6(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，充分搅拌混匀，4℃静置6h，5000r/min离心10min，收集上清液；E)往上述上清液按1:1的质量比加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解，加入终浓度0.06％(m/v)的SDS，混匀，4℃静置12h，5000r/min离心20min，收集沉淀，将沉淀用无菌生理盐水溶解后，经大孔树脂吸附除去去污剂，得浓缩液，过滤除菌，分装，即得。实施例2～3、禽腺病毒4型卵黄抗体制备实施例4～5与实施例1的区别在于步骤D)中加入的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯终浓度分别为0.2％(m/v)、1.0％(m/v)，其余参数与操作与实施例1相同。实施例4～5、禽腺病毒4型卵黄抗体制备实施例4～5与实施例1的区别在于步骤E)中加入的SDS的终浓度分别为0.01％(m/v)、1％(m/v)，其余参数与操作与实施例1相同。实施例6、禽腺病毒4型卵黄抗体制备实施例6与实施例1的区别在于，去污剂为CMC值为0.24的TritonX-100，其余参数与操作与实施例1相同。实施例7、禽腺病毒4型卵黄抗体制备实施例7与实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.禽腺病毒4型卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A)用禽腺病毒4型灭活疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄，进一步获得卵黄液；B)将上述卵黄液与Tris‑HCl缓冲盐溶液混合，加入苯酚溶液，混匀，静置，低速离心，收集上清液；C)往上清液中加入终浓度为0.2～1.0(m/v)的聚乙二醇15‑羟基硬脂酸酯，搅拌混合，静置，离心，收集上清液；D)将步骤C)得到的上清液经纯化、浓缩、无菌步骤，得到卵黄抗体。

【技术特征摘要】
1.禽腺病毒4型卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A)用禽腺病毒4型灭活疫苗免疫蛋鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒后，分离蛋白，收集卵黄，进一步获得卵黄液；B)将上述卵黄液与Tris-HCl缓冲盐溶液混合，加入苯酚溶液，混匀，静置，低速离心，收集上清液；C)往上清液中加入终浓度为0.2～1.0(m/v)的聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯，搅拌混合，静置，离心，收集上清液；D)将步骤C)得到的上清液经纯化、浓缩、无菌步骤，得到卵黄抗体。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中卵黄液与Tris-HCl缓冲盐按1：(3～6)的体积比混合。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中卵黄液与苯酚溶液按1：(1～3)的体积比混合。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤具体为：往上述上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，谢秉超，严悌昆，敖艳华，刘为和，
申请(专利权)人：广州渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44