一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及灭活疫苗领域，针对疫苗安全性较差的问题，提供了一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法，该技术方案如下：按体积比计，水相和油相按照2‑4:1的比例组成，所述水相由吐温‑80、鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒按照4:48:48的比例组成，所述油相由丁酸酐、白油、硬脂酸铝、和司盘‑80按照1‑2：92‑96：1‑2：2‑4的比例组成；通过两种抗原与吐温‑80以特定的体积比构成水相，并且在油相中加入丁酸酐，以一定的比例配合白油、硬脂酸铝和司盘‑80制成油相然后再混合水相制备疫苗，使得免疫后的鸭体能够产生较高的抗体，增加鸭体的免疫性能，疫苗对鸭体安全作用较佳。

A double inactivated vaccine of duck reovirus and duck adenovirus and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及灭活疫苗领域，尤其是涉及一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
近年来，在两广、浙、闽、豫和鄂等省爆发了以鸭肝脏上有白色坏死点为特征的病，本病在遇到混合感染或应激时死亡率非常高。通常，此病主要发生于7～45日龄番鸭，致病率高达20％～90％，死亡率为10～50％。感染鸭多表现为腹海，软脚，附关节或趾关节不同程度肿胀，耐过鸭变为僵鸭，剖检可见肝、脾、胰、肾和肠的坏死。此以肝脏不规则坏死、出血斑点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，俗称"鸭新肝病"、"鸭坏死性肝炎病"等，经分离鉴定其病原为呼肠孤病毒科中的番鸭呼肠孤病毒。并且，我国多品种鸭容易受到I群2型腺病毒病感染，该疾病以心包积液和肝坏死为特征，经鉴定I群2型腺病毒病主要由鸭腺病毒所引起，番鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒均是番鸭的重要传染病，番鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒往往混合感染，使得鸭体要经过多次注射不同疫苗进行预防或者治疗，多次重复注射，容易造成其他并发症的出现，使得灭活疫苗的安全性较差，因此，还有改善的空间。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备，二联灭活疫苗具有较高安全性的优点。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，按体积比计，水相和油相按照2-4:1的比例组成，所述水相由吐温-80、鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒按照4:48:48的比例组成，所述油相由丁酸酐、白油、硬脂酸铝、和司盘-80按照1-2：92-96：1-2：2-4的比例组成。通过采用上述技术方案，通过两种抗原与吐温-80以特定的体积比构成水相，并且在油相中加入丁酸酐，以一定的比例配合白油、硬脂酸铝和司盘-80制成油相然后再混合水相制备疫苗，使得制备成的二联灭活疫苗进入鸭体内后，番鸭爆发并发症的情况下降，进而使得鸭体能够产生较高的抗体，增加鸭体的免疫性能，当下次病毒侵袭鸭体时，抗体可迅速中和并清除特定的病毒，使得各组织器官内的病毒凋亡，阻碍病毒在机体内复制，恢复机体正常的功能，鸭体可同时免疫番鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒，可同时治疗番鸭呼肠孤病毒病和I群2型腺病毒病，减少多次注射不同疫苗鸭体出现并发症的情况，减少鸭体的应激反应，安全效果较佳。本专利技术进一步设置为：所述二联灭活疫苗还包括佐剂，所述抗原总和与佐剂的质量比例为1:1。通过采用上述技术方案，通过抗原与佐剂的质量比例为1:1，使得佐剂较好的辅助二联灭活疫苗发挥作用，促进鸭体对抗病毒的能力，增加了机体的免疫功能。本专利技术进一步设置为：所述佐剂包括荷叶粉，所述抗原总和与荷叶粉的质量比例为1:0.05-0.1。通过采用上述技术方案，通过在二联灭活疫苗中意外加入荷叶粉，使得鸭体可抑制其他由于鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒入侵鸭体内时激活其他病毒的情况，使得鸭体保持正常的生理活动状态。通过两种抗原与荷叶粉的质量比例为1:0.05-0.1，使得鸭体更加不容易出现其他并发症的产生，抑制其他病毒或者有害微生物的繁殖效果更佳，进而增加鸭体的免疫功能。本专利技术进一步设置为：所述佐剂还包括浓度为0.1％-0.3％(v/v)头孢噻呋钠，所述抗原总和与头孢噻呋钠的质量比例为1:0.01-0.03。通过采用上述技术方案，通过在二联灭活疫苗中加入头孢噻呋钠，使得鸭体的免疫性能较好，协助机体排除病毒，使得机体摆脱病毒的侵害。本专利技术进一步设置为：所述佐剂还包括浓度为2％-4％(v/v)植物血凝素，所述抗原总和与植物血凝素的质量比例为1:0.02-0.04。通过采用上述技术方案，通过在二联灭活疫苗中加入植物血凝素，有效刺激机体T淋巴细胞增殖，分化产生大量效应T细胞，杀伤病毒，使得机体的免疫性能提高。针对现有技术存在的不足，本专利技术的第二目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，具有步骤简便的优点。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1.宿主细胞的传代与培养：将宿主细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，添加细胞生长液继续培养，当宿主细胞形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；S2.病毒抗原的接种、培养：取步骤S1中已形成良好单层的宿主细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，在37℃条件下，吸附30～40分钟后吸弃病毒液，再用1～2％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获病变细胞，将病变细胞离心收集上清液得到病毒原液；S3.病毒抗原的灭活：加入灭活剂将步骤S2得到的病毒原液灭活；S4.配置疫苗制剂：将水相、油相混合，乳化分装。通过采用上述技术方案，通过病毒抗原经过一系列的培养等步骤，且不需要冻融过程，有效的保证了病毒抗原的质量，减少实验的成本，病毒原液病毒滴度不降低，并且使得制备的二联灭活疫苗质量较高，进而由二联灭活疫苗配置成的疫苗质量较佳，安全性较好。本专利技术进一步设置为：步骤S4所述油相制备的方法包括以下步骤：按体积比计，将白油92份加热到80-90℃，然后加入丁酸酐2份，混合均匀，继续升温至100℃-120℃条件下，然后继续添加硬脂酸铝2份和司盘-804份，直至溶解为止；所述水相制备的方法包括以下步骤：取检验合格的鸭呼肠孤病毒48份和鸭腺病毒48份与灭菌后的吐温-804份，搅拌均匀直至吐温-80被完全溶解。通过采用上述技术方案，通过制备油相过程中不断升温，使得白油、丁酸酐、硬脂酸铝及司盘-80混合的更为均匀，使得制备的油相与水相较好的配合形成疫苗，可增加病毒原液的滴度，减少病毒原液不进行反复冻融产生病毒抗原的质量较差的情况，保证了病毒抗原的质量，进一步提高了疫苗的安全性。本专利技术进一步设置为：所述宿主细胞为LMH细胞。通过采用上述技术方案，用LMH细胞进行鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可达到100倍的水平。本专利技术进一步设置为：所述灭活剂为0.1％福尔马林溶液。通过采用上述技术方案，通过用0.1％福尔马林灭活病毒抗原，使得得到的病毒抗原失去感染性，病毒抗原的质量较佳。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：1.通过提供一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，使得制备成的二联灭活疫苗进入鸭体内后，番鸭爆发并发症的情况下降，安全效果较佳；2.通过提供一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，对番鸭接种后，免疫后的番鸭精神状态良好，采食正常，并且接种的部位也没有产生过敏红肿等现象，具有较强的免疫效果；3.通过提供一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，不需要进行反复冻融步骤，减少了实验制备的成本，减少由于反复冻融产生污染的情况。具体实施方式以下实施例，对本专利技术作进一步详细说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，其特征是：按体积比计，水相和油相按照2-4:1的比例组成，所述水相由吐温-80、鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒按照4:48:48的比例组成，所述油相由丁酸酐、白油、硬脂酸铝、和司盘-80按照1-2：92-96：1-2：2-4的比例组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，其特征是：按体积比计，水相和油相按照2-4:1的比例组成，所述水相由吐温-80、鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒按照4:48:48的比例组成，所述油相由丁酸酐、白油、硬脂酸铝、和司盘-80按照1-2：92-96：1-2：2-4的比例组成。


2.根据权利要求1所述的一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：
S1.宿主细胞的传代与培养：将宿主细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，添加细胞生长液继续培养，当宿主细胞形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
S2.病毒抗原的接种、培养：取步骤S1中已形成良好单层的宿主细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，在37℃条件下，吸附30～40分钟后吸弃病毒液，再用1～2％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获病变细胞，将病变细胞离心收集上清液得到病毒原液；
S3.病毒抗原的灭活：加入灭活剂将步骤S2得到的病毒原液灭活；
S4.配置疫苗制剂：将水相、油相混合，乳化分装。


3.根据权利要求2所述的一种鸭呼肠孤病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：步骤S4所述油相制备的方法包括以下步骤：按体积比计，将白油92份加热到80-90℃，然后加入丁酸酐2份，混合均匀，继续升温至100℃-120℃条件下，然后继续添加硬脂酸铝2份和司盘-804份，直至溶解为止；所述水相制备的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：严悌昆，谢秉超，张毓金，黄淑芬，张桂平，
申请(专利权)人：广州渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44