一种治疗宫颈癌的scFv抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种治疗宫颈癌的scFv抗体、编码基因及scFv抗体的应用，该scFv抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区中包含轻链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；所述重链可变区中包含重链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14。通过使用本发明专利技术的scFv抗体制备的药物的治疗，相对于传统的治疗手段，具有能够从源头上清除癌细胞，防止转移和复发，能够延长患者的生存周期和生活质量，减少患者的痛苦的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗宫颈癌的scFv抗体及其应用
本专利技术属于抗体药物领域，具体涉及一种治疗宫颈癌的scFv抗体及其应用。
技术介绍
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，我国每年新增病例约13.5万，占全球发病数量的三分之一。根据病理组织形态不同，宫颈癌可分为鳞癌和腺癌等。其中鳞癌发病率最高，占宫颈癌的70％。腺癌仅占20％左右，但低分化腺癌恶性程度高，死亡率高，多见于年轻女性。人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染，特别是高危型病毒的持续感染，是引起宫颈癌的主要原因。中国女性最常见、感染最严重的5种高危型HPV分别是16、18、58、52和33，占宫颈癌的93％。其中HPV16在宫颈鳞癌及类型不明宫颈肿瘤中感染率都非常高，超过65％，是危险程度最高的一种HPV。在宫颈腺癌中HPV18感染率为35.7％，接近HPV16的42.6％感染率。HPV的致病机制包括HPVDNA整合至细胞基因组，诱导宫颈细胞发生异常和突变，抑制p53蛋白的功能，破坏抑癌基因的表达等。目前，对于HPV引起的宫颈癌，采取的主要措施是接种HPV疫苗进行预防，国内外已有多种HPV疫苗上市。但是，一种HPV疫苗只能预防特定亚型的HPV感染，保护范围有限，且对已经感染HPV的女性缺少保护作用。因此，对HPV感染导致的宫颈癌患者进行治疗，是必不可缺的任务。目前，除了非常早期的宫颈癌可根据肿瘤、患者特征通过局部或根治性手术治愈外，放疗和细胞毒药物仍然是宫颈癌治疗的基石。联合放化疗及基于顺铂的放化疗之后的辅助治疗，获得进一步疗效，随之而来的是更高的毒性率。传统的手术、化疗、放疗、冷冻和靶向治疗等方法无法治愈宫颈癌。免疫疗法在最近几年中取得了巨大进展，具有根治肿瘤的潜力，受到各国研究机构、医院、企业和政府的强烈关注。免疫疗法通过激活或重建机体免疫系统功能，通过肿瘤微环境的免疫隔离和抑制作用，达到杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤免疫疗法主要包括非特异性免疫刺激、免疫检验点单克隆抗体治疗、过继性免疫细胞治疗和肿瘤疫苗等方法。其中CAR-T(chimericantigenreceptorTcell)和TCR-T(genemodifiedTCRTcell)是肿瘤免疫细胞治疗的最重要代表。目前，针对HPV相关的宫颈癌，主要是开发靶向识别HPV-16/18的E6/E7多肽-MHC复合物的特异性TCR-T，如KitePharma和蓝鸟生物开发靶向HPV-16E6的TCR-T。但是，TCR-T研发步骤多，技术难度大，时间长，成本高。手术主要是用于治疗非常早期的宫颈癌，对于已经恶化的中晚期宫颈癌无能为力。化疗和放疗是目前治疗宫颈癌治疗的主要方法，但对患者毒副作用大，给患者带来痛苦，只能延缓病程，不能治愈宫颈癌。免疫疗法具有根治肿瘤的潜力，已经开展大量的临床试验，其中诺华和Kite开发的治疗白血病的CD19CAR-T细胞获得FDA批准上市。CAR-T细胞识别肿瘤细胞表面高表达的肿瘤相关抗原，包括蛋白、脂类和糖类等分子，靶点范围广。但是，大多数的肿瘤相关抗原，尤其是实体瘤，也在正常细胞表面低表达，因此，治疗实体瘤的CAR-T细胞存在脱靶毒性，限制了CAR-T的临床研究和治疗。因此，发掘只在肿瘤细胞表面表达，而在正常细胞不表达的抗原，具有非常重要的意义和应用价值。在HPV感染的宫颈癌细胞中表达的外源性E6和E7等蛋白，被细胞内蛋白酶体切割后，以多肽抗原-MHC复合物的形式呈递在细胞膜表面，被患者T细胞的TCR识别。该类多肽抗原-MHC复合物只在肿瘤细胞表面表达，属于HPV感染的肿瘤细胞特异性抗原。但是识别多肽抗原-MHC复合物的T细胞数量少，或者杀伤功能被抑制，肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤。
技术实现思路
由于TCR-T的诸多限制，CAR-T采用scFv抗体片段代替TCR的胞外受体片段，能够以非MHC依赖的方式识别靶细胞，大大拓展了识别的靶细胞范围。此外，CAR-T的研发相对比较容易，减少时间，降低成本。为达到高特异性杀伤HPV感染的宫颈癌细胞，避免CAR-T脱靶毒性的目的，本专利技术以HPV16E7蛋白的第11个氨基酸至第19个氨基酸的多肽(YMLDLQPET)序列和人HLA-A0201表位组装的抗原复合物作为CAR-T细胞识别HPV16阳性宫颈癌细胞的靶点，开发一种特异性识别HPV16E7多肽抗原-MHC复合物的scFv抗体及其编码基因；还公开了scFv抗体的制作试剂盒和制药用途，为CAR-T治疗宫颈癌的临床转化奠定理论和技术基础。本专利技术提供一种治疗宫颈癌的scFv抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区中包含轻链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11；所述重链可变区中包含重链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14。本专利技术还提供一种DNA分子，编码所述的scFv抗体。优选地，所述的DNA分子含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的分别编码所述轻链CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列、以及SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7所示的分别编码所述重链CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列。所述DNA分子可用于构建工程菌，表达scFv抗体。本专利技术还提供一种表达载体，含有所述的DNA分子的核苷酸序列以及与该DNA分子的核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。优选地，所述的表达载体为慢病毒载体。本专利技术还提供一种遗传工程化宿主细胞，被所述表达载体转化。优选地，所述遗传工程化宿主细胞为T细胞。所述遗传工程化宿主细胞可用于表达scFv抗体。本专利技术还提供一种试剂盒，包括所述scFv抗体。本专利技术还提供所述的scFv抗体用于制备预防或治疗与人乳头状瘤病毒相关的疾病的药物或诊断和治疗试剂中的用途。优选地，所述预防或治疗与人乳头状瘤病毒相关的疾病的药物或诊断和治疗试剂为治疗宫颈癌的药物。有益效果：本专利技术以HPV16E7蛋白的第11个氨基酸至第19个氨基酸的多肽(YMLDLQPET)序列和人HLA-A0201表位组装的抗原复合物作为CAR-T细胞识别HPV16阳性宫颈癌细胞的靶点，免疫多肽抗原-MHC复合物得到抗多肽抗原-MHC复合物的scFv抗体，体外实验验证了其有效性；通过制备的药物的治疗，相对于传统的治疗手段，能够从源头上清除癌细胞，防止转移和复发，能够延长患者的生存周期和生活质量，减少患者的痛苦。附图说明图1CAR的结构示意图；图2为HLA-A0201-BSPSDS-PAGE图；图3为HLA-A0201:HPV16E7(11-19)的生物素化修饰的图；图4为HLA-A0201:HPV16E7(11-19)四聚体SDS-PAGE电泳图；图5为小鼠抗血清效价检测曲线图；图6为细胞杀伤试验的细胞存活率图。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本专利技术。实施例1本专利技术以HPV16E7蛋白的第11个氨基酸至第19个氨基酸的多肽(YMLDLQPET)序列和人类淋巴细胞抗原人HLA-A0201表位组装的抗原复合物作为CAR-T细胞识别HPV16阳性宫颈癌细胞的靶点。本专利技术的配方包括如下内容。(1)识本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗宫颈癌的scFv抗体，其特征在于，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区中包含轻链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；所述重链可变区中包含重链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14。

【技术特征摘要】
1.一种治疗宫颈癌的scFv抗体，其特征在于，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区中包含轻链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11；所述重链可变区中包含重链CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别为SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14。2.一种DNA分子，其特征在于，编码权利要求1所述的scFv抗体。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示的分别编码所述轻链CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列、以及SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7所示的分别编码所述重链CDR1、CDR2、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：张英，张赛，滕娇，曾宪卓，
申请(专利权)人：深圳市宝安区中心医院，
类型：发明
国别省市：广东,44