悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法，首先将重组杆状病毒转染至对数期昆虫细胞中，96h后取上清，收获P0代重组杆状病毒液；原代重组杆状病毒细胞传代培养，以传代接种细胞密度≥3‑5×10^5个的接种量接入三角瓶，至细胞密度生长至2‑3×10^6个，再次传代培养，密度达2×10^6cells/mL时，以MOI为0.1‑0.5进行接毒P0代病毒液，收获细胞培养上清液，离心处理后为病毒液P1代，锡箔纸包裹4℃避光保存；重复以上方法，制得P2代病毒液；继续传代，当密度达到2×10^6cells/mL时，以MOI为1‑5进行接毒P2代病毒液，3‑5天后收获细胞培养上清液，离心处理后为病毒液P3代，效价检测后，得到重组TPO蛋白。本发明专利技术方法制备的抗原特异性好，灵敏度高且效价高，能大大提高试剂盒的灵敏度、精密性和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法
本专利技术涉及生物检测技术，尤其是涉及一种悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法。
技术介绍
杆状病毒是近年来被广泛用于高效表达外源蛋白的载体系统，杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160kb，其基因组可在昆虫细胞核内复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，后者具有较大的柔韧性，可以容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。用杆状病毒做载体，可高效表达外源基因，到目前为止已有几百个包括动植物、病毒、细菌、真菌的基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达。这个表达体系的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。这一特点优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配。因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。甲状腺过氧化物酶（thyroidperoxidase，TPO）是催化甲状腺激素的重要酶。TPO由甲状腺滤泡细胞合成，它是由933个氨基酸残基组成的分子量为103kD的10%糖化的血色素样蛋白质。TPO是催化甲状腺激素合成的关键酶，它参与了TG（甲状腺球蛋白）酪氨酸残基的碘化和碘化酪氨酸的偶联作用，与自身免疫性甲状腺疾病的发生、发展密切相关。TPOAb（甲状腺过氧化物酶抗体）作为自身免疫性甲状腺病的主要自身抗体可引起甲状腺滤泡损伤，导致甲状腺功能减退。甲亢是一种常见的自身免疫性疾病，TPOAb对于甲亢的发病机制、诊断治疗及预后判断有重大意义。重组TPO蛋白在甲状腺过氧化物酶抗体检测试剂盒中作为抗原使用，要求生物活性高、灵敏度高。前期制备该重组TPO蛋白采用spinner培养法。由于Spinner培养时，培养体积是瓶体积的1/2，但是瓶盖又不通气，因此细胞生长过程的DO较难保障，从而导致出现效价低的现象；另一方面，Spinner瓶是玻璃瓶，且有2个玻璃转子，使用时需特别小心，容易破损，且价格较贵，另外每个Spinner设备仅能容纳4个瓶位，容纳瓶位较少，放大需重新采购设备，放大困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法，制备出的TPO蛋白生物活性高，应用于甲状腺过氧化物酶抗体检测试剂盒中，能大大提高试剂盒的灵敏度、精密性和稳定性。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法包括下述步骤：第一步，按照常规方法，将重组杆状病毒转染至处于对数期昆虫细胞中，96h后取上清，收获P0代重组杆状病毒液；第二步，原代重组杆状病毒细胞经静止培养复苏后，经传代培养，以传代接种细胞密度≥3-510^5个的接种量接入三角瓶中，至细胞密度生长至2-310^6个时，再次进行传代培养，至细胞处于对数期，密度达到210^6cells/mL时，以MOI为0.1-0.5进行接毒P0代病毒液，3-5天后收获细胞培养上清液，离心处理后收集上清，为病毒液P1代，锡箔纸包裹后4℃避光保存；第三步，重复第二步方法，制得P2代病毒液；第四步，继续传代，当细胞处于对数期，密度达到210^6cells/mL时，以MOI为1-5进行接毒P2代病毒液，3-5天后收获细胞培养上清液，离心处理后收集上清，为病毒液P3代，效价检测后，得到重组TPO蛋白。所述第二步中传代培养的条件为温度27℃，摇床转速100rpm/min。所述第二步、第四步中离心处理的条件为转速1500rpm/min，时间3-5分钟。本专利技术的优点在于应用杆状病毒昆虫细胞表达的抗原，抗原结构与天然蛋白更为接近，且无需变性纯化，抗原的活性较好；特殊采用摇床培养进行重组杆状病毒P1-P3代病毒液的制备及放大，病毒滴度较静止培养制备病毒液提升10倍，三角瓶培养制备的抗原效价较和spinner培养制备的抗原提升5倍，并且更利于放大。试验检测，本专利技术方法制备的抗原特异性好，灵敏度高且效价高，用于甲状腺过氧化物酶抗体检测试剂盒，能大大提高试剂盒的灵敏度、精密性和稳定性。附图说明图1是本专利技术方法制备的抗原与对照抗原临床符合率对比。具体实施方式下面对本专利技术方法作更加详细的说明，以便于本领域技术人员对本申请的理解。如无特殊说明，本专利技术方法中所用的试剂和设备均为市售产品，采用的方法也为本行业常规使用的方法。实施例1重组TPO蛋白（抗原）的制备第一步，按照工Invitrogen公司生产的CellfectinⅡ试剂盒说明书的方法，将重组杆状病毒转染至对数期昆虫细胞中，96h后取上清，收获P0代重组杆状病毒液，其具体操作如下：1、将细胞以1-1.2x106个细胞/孔的数量铺六孔板，过夜后细胞即可长满板底85%左右；2、制备A溶液--质粒/培养基：将质量为2ug重组Bacmid质粒加入到100ul无血清、无双抗的SF900ⅢSFM中轻轻混匀；3、制备B溶液-脂质体/培养基：将体积8uL的CellfectinⅡ加入到100ul无血清、无双抗的SF900ⅢSFM培养基中，轻轻混匀；4、制备C溶液：将A溶液和B溶液进行混合，轻轻混匀后室温孵育20min；5、取出第1步所铺六孔板，弃上清，用无血清、无双抗的SF900ⅢSFM培养基洗板一次，将C溶液逐滴加入六孔板内，轻晃使其混匀，27℃培养4h；6、将上清吸出，加入1.5mlSF-900III培养基，27度培养4d（96h），观察荧光是否出现：若荧光率大于85%以上，收取上清，1500rpm/min离心3-5min，收集上清，为病毒液P0代，锡箔纸包裹后4℃避光保存。第二步，P1代病毒液的制备：将原代细胞静止培养复苏后，经过传代培养，以传代接种细胞密度不低于3-510^5个的接种量接入250mL三角瓶中，三角瓶装液量为总体积的1/5（50mL），细胞密度生长至2-310^6个时，进行传代培养，培养温度27℃，摇床转速100rpm/min。连续传代2-3次后，细胞状态较好，成活率大于95%。取处于对数期细胞，以8×10^5cells/mL接种250mL三角瓶，密度达到210^6cells/mL时，以MOI为0.1-0.5进行接毒P0代病毒液，3-5天后收获细胞培养上清液，将细胞培养上清液在转速1500rpm/min离心3-5min，收集上清，为病毒液P1代，锡箔纸包裹后4℃避光保存。第三步，P2代病毒液的制备：将原代细胞经过静止培养复苏后，经过传代培养，以传代接种细胞密度不低于3-510^5个的接种量接入500mL三角瓶中，三角瓶装液量为总体积的1/5（100mL），细胞密度生长至2-310^6个时，进行传代培养，培养温度27℃，摇床转速100rpm/min。连续传代2-3次后，细胞状态较好，成活率大于95%。取处于对数期细胞，以810^5cells/mL接种250mL三角瓶，密度达到210^6cells/mL时，以MOI为0.1-0.5进行接毒P1代病毒液，3-5天后收获细胞培养上清液，将细胞培养上清液在转速1500rpm/min离心3-5mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，按照常规方法，将重组杆状病毒转染至处于对数期昆虫细胞中，96h后取上清，收获P0代重组杆状病毒液；第二步， 原代重组杆状病毒细胞经静止培养复苏后，经传代培养，以传代接种细胞密度≥3‑5×10^5 个的接种量接入三角瓶中，至细胞密度生长至2‑3×10^6 个时，再次进行传代培养，至细胞处于对数期，密度达到2×10^6cells/mL时，以MOI为0.1‑0.5进行接毒P0代病毒液，3‑5天后收获细胞培养上清液，离心处理后收集上清，为病毒液P1代，锡箔纸包裹后4℃避光保存；第三步，重复第二步方法，制得P2代病毒液；第四步，继续传代，当细胞处于对数期，密度达到2×10^6cells/mL时，以MOI为1‑5进行接毒P2代病毒液，3‑5天后收获细胞培养上清液，离心处理后收集上清，为病毒液P3代，效价检测后，得到重组TPO蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种悬浮培养昆虫细胞制备重组TPO蛋白的方法，其特征在于：包括下述步骤：第一步，按照常规方法，将重组杆状病毒转染至处于对数期昆虫细胞中，96h后取上清，收获P0代重组杆状病毒液；第二步，原代重组杆状病毒细胞经静止培养复苏后，经传代培养，以传代接种细胞密度≥3-5×10^5个的接种量接入三角瓶中，至细胞密度生长至2-3×10^6个时，再次进行传代培养，至细胞处于对数期，密度达到2×10^6cells/mL时，以MOI为0.1-0.5进行接毒P0代病毒液，3-5天后收获细胞培养上清液，离心处理后收集上清，为病毒液P1代，锡箔纸包裹后4℃避光保存；第三...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙静静，陈超，赵巧辉，李桂林，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41