一种发酵液提取谷胱甘肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其包括蛋白沉淀、第一清液制备、谷胱甘肽沉淀、第二清液制备、谷胱甘肽纯化、谷胱甘肽结晶6个步骤。本发明专利技术的有益效果在于：在菌体破壁后加入一定量的强酸，使菌体破壁更加充分从而提高谷胱甘肽的收率，同时也使发酵液中的蛋白质变性沉淀，降低了谷胱甘肽在铜盐沉淀过程中未知杂质的干扰。本发明专利技术的方法既增强了菌体破壁的效果提高收率，又降低了铜盐沉淀过程中杂质的干扰提高纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵液提取谷胱甘肽的方法
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种发酵液提取谷胱甘肽的方法。
技术介绍
谷胱甘肽(Glutathione,GSH)，全称γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的含巯基的生物活性三肽化合物，是生物体内重要的非蛋白巯基化合物之一。谷胱甘肽普遍存在于动植物细胞和微生物中，尤其在酵母、小麦胚芽以及人和动物肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较为丰富。它主要以还原型(GSH)和氧化型(GSSH)两种形态存在，其中在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽，本专利技术中提及的谷胱甘肽均是指还原型的谷胱甘肽。谷胱甘肽具有多种生理功能，尤以抗氧化和整合解毒作用最为突出，同时谷胱甘肽在细胞增殖、凋亡、成纤维过程中也扮演着重要角色。随着研究的不断深入，谷胱甘肽在临床医学、保健品、食品添加剂以及动物饲料等方面的应用正引起广泛的关注，市场前景需求量正日益加大。然而，国内生产谷胱甘肽的工艺还不够成熟，其发展瓶颈主要在于发酵水平低下，后续提纯工艺收率低，因而所得产品纯度低、质量差、成本高。高纯度地从发酵液获得谷胱甘肽一直是谷胱甘肽产业化的障碍，也日益成为研究的热点之一。解决上述问题对实现我国GSH大规模产业化，改变GSH原料依赖进口的尴尬局面并推动我国医学工业、保健行业和食品工业的发展有着十分重要的意义，同时具有良好的经济效益和社会效益。现有技术中，已报道的关于从发酵液中提纯分离出GSH的方法主要有：铜盐法、离子交换法、亲和层析法、双水相萃取、反胶束萃取等。其中，铜盐法作为一种传统的提取方法，选择性强，收率高且易于操作，有很强的实用价值；然而，在操作过程中，由于发酵液成分复杂，类似物多，容易引入杂质而造成产品纯度不高。离子交换法也是一种提纯GSH的常用手段，但是，所用填料成本偏高且使用寿命偏短，生产周期长且废水处理量大，因而在工业生产中常被限制。其中，亲和层析法是一种有效分离GSH的方法，但含汞树脂稳定性差且易泄露，因此不宜在食品药品领域应用。应用双水相萃取法分离GSH，虽然效率较高，但由于双水相组成系统一般比较昂贵，生产成本高，这使得它在技术上的优势被削弱。其中，反胶束萃取谷胱甘肽是一种很有发展潜力的方法，但其工业化大规模应用还不成熟，目前还处于实验室研究阶段。由此可见，铜盐法因其选择性强、收率高、易于工业操作等诸多优点，一直倍受青睐。但由于发酵液成分复杂，类似物较多，且铜盐法可优化空间有限，许多发酵法生产谷胱甘肽的厂家经铜盐法提取后仍有许多杂质存在，现有铜盐法技术尚未有解决这一难题的办法。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，使得所提取的谷胱甘肽收率更高的同时也易于操作和工业生产。为了实现上述目的，本专利技术所采用的的技术方案是：一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：(1)蛋白沉淀步骤：将富含谷胱甘肽的菌体加入强酸后搅拌沉淀，使富含谷胱甘肽的菌体充分破壁并沉淀蛋白得到第一匀浆；(2)第一清液制备步骤：将步骤(1)制得的所述第一匀浆用酸调节pH后离心过滤，得到第一清液；(3)谷胱甘肽沉淀步骤：向步骤(2)制得的第一清液中加入沉淀剂后搅拌反应，使谷胱甘肽形成沉淀后离心，收集清洗沉淀；(4)第二清液制备步骤：收集步骤(3)制得的清洗沉淀并用纯化水悬起形成第二匀浆，在所述第二匀浆中加入硫化物，搅拌反应，使谷胱甘肽重新游离至上清液中，得到第二清液；(5)谷胱甘肽纯化步骤：在步骤(4)中所述的第二清液中加入活性炭脱色并离心过滤，得到第三清液后减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；(6)谷胱甘肽结晶步骤：采用乙醇溶液对步骤(5)制得的谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品后真空干燥得纯品。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(1)中所述的强酸包括三氯乙酸、三氟乙酸、冰醋酸中的任意一种或两种以上的混合，优选三氯乙酸。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(1)中所述的强酸的加入量以所述第一匀浆的体积为基准，加入量的范围为1％-5％，优选2％-3％。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(1)中所述的搅拌沉淀为300-400rpm搅拌沉淀20-30min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(2)中，所述用于调节pH的酸包括硫酸，所述调节pH的范围为1.5-2.5。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(2)中，所述离心的速度为6000-8000rpm，时间范围为60-80min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(3)中，所述沉淀剂包括氧化亚铜、氯化亚铜、氧化铜、硫酸铜的任意一种或两种以上的混合，优选氧化亚铜。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(3)中，所述沉淀剂加入比例，按物质的量计，范围为1:1-2:1。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(3)中，所述的搅拌反应的速度范围为300-400rpm，时间范围为120-150min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(3)中，所述离心的速度范围为6000-8000rpm，时间范围为30-45min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(3)中，所述收集清洗沉淀为收集沉淀用纯化水淋洗，洗至所述第一清液中不再检出盐分。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(4)中，所述硫化物包括硫化氢、硫化钠、硫化钾、硫化铵中任意一种或两种以上的混合，优选硫化氢。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(4)中，所述的搅拌反应为300-400rpm搅拌反应120-150min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(5)中，所述加入活性炭脱色为按照0.5％质量分数向所述第二清液中加入活性炭，200-300rpm搅拌脱色30-45min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(5)中，所述离心过滤的速度范围为4000-5000rpm，时间范围为20-30min，使用的过滤膜的孔径范围为0.22μM。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(5)中，所述减压浓缩为-0.07Mpa-0Mpa压力下，在55～65℃下进行减压浓缩。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(6)中，步骤(6)中，所述乙醇溶液为预热至55-65℃的50-60％的乙醇溶液。本专利技术的主要创新点在于：在菌体破壁后加入一定量的强酸，使菌体破壁更加充分从而提高谷胱甘肽的收率，同时也使发酵液中的蛋白质变性沉淀，降低了谷胱甘肽在铜盐沉淀过程中未知杂质的干扰。本专利技术的方法既增强了菌体破壁的效果提高收率，又降低了铜盐沉淀过程中杂质的干扰提高纯度。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本专利技术的限制。实施例1向60L发酵菌体中(含GSH257g)只加入硫酸，调节pH至2，充分破壁后用转速为6000rpm离心机离心所述发酵液，得到富含谷胱甘肽的上清液。按照比例物质的量0.5:1的比例向清液中加入氧化亚铜，400rpm搅拌反应60min，得到GSCu沉淀悬浮液；用转速为6000rpm离心机离心，得到GSCu沉淀，收集沉淀并用4倍体积纯化水搅拌悬起，制得GSCu沉淀悬浮液；将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中通入硫化氢，并以250rpm的转速搅拌反应2小时，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000rpm离心机离心所述谷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：(1)蛋白沉淀步骤：将富含谷胱甘肽的菌体加入强酸后搅拌沉淀，使富含谷胱甘肽的菌体充分破壁并沉淀蛋白得到第一匀浆；(2)第一清液制备步骤：将步骤(1)制得的所述第一匀浆用酸调节pH后离心过滤，得到第一清液；(3)谷胱甘肽沉淀步骤：向步骤(2)制得的第一清液中加入沉淀剂后搅拌反应，使谷胱甘肽形成沉淀后离心，收集清洗沉淀；(4)第二清液制备步骤：收集步骤(3)制得的清洗沉淀并用纯化水悬起形成第二匀浆，在所述第二匀浆中加入硫化物，搅拌反应，使谷胱甘肽重新游离至上清液中，得到第二清液；(5)谷胱甘肽纯化步骤：在步骤(4)中所述的第二清液中加入活性炭脱色并离心过滤，得到第三清液后减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；(6)谷胱甘肽结晶步骤：采用乙醇溶液对步骤(5)制得的谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品后真空干燥得纯品。

【技术特征摘要】
1.一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：(1)蛋白沉淀步骤：将富含谷胱甘肽的菌体加入强酸后搅拌沉淀，使富含谷胱甘肽的菌体充分破壁并沉淀蛋白得到第一匀浆；(2)第一清液制备步骤：将步骤(1)制得的所述第一匀浆用酸调节pH后离心过滤，得到第一清液；(3)谷胱甘肽沉淀步骤：向步骤(2)制得的第一清液中加入沉淀剂后搅拌反应，使谷胱甘肽形成沉淀后离心，收集清洗沉淀；(4)第二清液制备步骤：收集步骤(3)制得的清洗沉淀并用纯化水悬起形成第二匀浆，在所述第二匀浆中加入硫化物，搅拌反应，使谷胱甘肽重新游离至上清液中，得到第二清液；(5)谷胱甘肽纯化步骤：在步骤(4)中所述的第二清液中加入活性炭脱色并离心过滤，得到第三清液后减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；(6)谷胱甘肽结晶步骤：采用乙醇溶液对步骤(5)制得的谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品后真空干燥得纯品。2.如权利要求1所述的一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的强酸包括三氯乙酸、三氟乙酸、冰醋酸中的任意一种或两种以上的混合。3.如权利要求1所述的一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的强酸的加入量以所述第一匀浆的体积为基准，加入量的范围为1％-5％。4.如权利要求1所述的一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的搅拌沉淀为300-400rpm搅拌沉淀20-30min。5.如权利要求1所述的一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述用于调节pH的酸包括硫酸，所述调节pH的范围为1.5-2.5。6.如权利要求1所述的一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述离心的速度范围为6000-8000rpm，时间范围为60-80min。7.如权利要求1所述的一种发酵液提取谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述沉淀剂包括氧化亚铜、氯化亚铜、氧化铜、硫酸铜...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤晶，刘世领，韦建国，
申请(专利权)人：上海青平药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31