一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌及其应用，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)G9R‑3，CCTCC NO：M 2017747；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年11月30日。本发明专利技术具有以下有益效果：筛选分离出一株新的解淀粉芽孢杆菌，该菌株对香蕉枯萎病菌具有效果极佳的抑制作用，对于防治香蕉枯萎病具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
香蕉枯萎病，又名巴拿马病和黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，简称Foc)引起的一种维管束坏死的毁灭性香蕉真菌病害和典型的土传病害。该病传播途径广，致病力强，蔓延速度快，感染率高，防治难，植株受感染后死亡率高，被称为“香蕉癌症”。香蕉枯萎病一旦发生就极具毁灭性，对香蕉产业的危害十分严重。此病1874年在澳大利亚被发现，上世纪中叶在巴拿马及南美洲的几个国家大面积爆发，约有43hm2的香蕉园遭毁,使风靡全球的国际贸易香蕉品种大米七(GrosMichel)退出历史舞台，并通过香蕉出口传播到全世界。到上世纪50年代，除了南太平洋、地中海、马来西亚的一些岛屿外，世界其他地方均有香蕉枯萎病的发生。植物内生菌泛指那些在其生活史中的某一阶段生活在植物组织内,对植物组织不引起明显病害症状的微生物,包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生活的腐生微生物和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原微生物和菌根真菌。植物内生菌的研究开始于1997年Bacon等对高羊茅内生真菌的研究,随后人们对众多作物,如甜菜、烟草、甘草、辣椒、柑橘、棉花、水稻、哈密瓜等内生细菌开展了研究。研究表明许多内生菌与宿主形成互利的共生关系,即宿主为内生菌提供充足的营养促进其生长。同时内生菌在宿主应对外界环境的应激耐受性(包括抗旱、抗病虫害及对病原体拮抗等)、宿主植物的生长、宿主植物中的有效活性成分的产生等方面也产生重要影响。植物内生菌的防病机理主要表现在通过产生抗生素类、水解酶类、植物生长调节剂和生物碱类物质,与病原菌竞争营养物质,增强宿主植物的抵抗力以及诱导植物产生系统抗性等途径抑制病原菌生长。研究还表明接种健康香蕉植株中内生菌的香蕉组培苗不仅可以减轻枯萎病的发病率,还可以促进植株的生长。在植物病害生防细菌中，应用较多的是芽孢杆菌(Bacillusspp.)。它是一类重要的微生物资源，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线、电磁辐射和有机溶剂的芽孢，可以耐受各种不良的环境条件。田间应用已证实，芽孢杆菌的生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂。并且可以将芽孢杆菌做成粉剂、液剂。粉剂容易储存，便于运输，大规模生产工艺简单，成本较低。因此，芽孢杆菌是目前一种较为理想的生防微生物。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)G9R-3，CCTCCNO：M2017747；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年11月30日。在本专利技术中，进一步说明，所述该菌株在LA培养基或NA培养基上生长良好，菌落呈灰白色，边缘不规则，不透明，粘着，扩展。镜检呈短杆状，具鞭毛，有芽孢；在pH＝4.0-9.0、20℃-50℃的环境下都能够生长；革兰氏染色呈阳性；氧化酶、接触酶测定为阳性；甲基红(M.R)测定呈阴性；在pH＝7.0时V-P测定生成红色化合物；3-酮基乳糖检测呈阴性；七叶灵水解检测呈阳性；纤维素水解、淀粉水解检测呈阴性；牛奶水解、糖醇类发酵检测呈阳性；明胶液化试验呈阳性；脲酶反应呈阳性；酯酶反应、精氨酸双水解酶检测呈阴性；在含有质量浓度2％-5％的NaCl的LA培养基和NA培养基上均能生长。分子鉴定解淀粉芽孢杆菌G9R-3CCTCCNo：M2017747的16SrDNA全序列如序列1所示，全长为1427bp。相应的，本专利技术还提供一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌的分离筛选方法，包括以下几个步骤：A：取香蕉表面消毒后的根部组织在研钵中，加入无菌水进行研磨，取滤液，稀释后，取稀释液涂布于NA培养基平板上，培养后，吸取最后一次清洗样品的无菌水涂布平板检测消毒是否彻底；挑取所有单菌落分别转接划线在新的NA培养基平板上，分离纯化；将纯化后的内生细菌单菌落接种于含NA培养液的瓶中，摇菌，与灭菌的甘油混合，保存备用；B：用平板对峙法从步骤A挑取的菌落中筛选出对香蕉枯萎病菌有抑菌作用的菌株。优选的，所述步骤A中，消毒采用质量浓度为75％的酒精漂洗1-2min，无菌水清洗1次，放入质量浓度为3.25％活性次氯酸钠中浸泡15-20min，质量浓度为75％的乙醇溶液中表面消毒1min，然后用无菌水清洗3-5次。优选的，在步骤B中，所述平板对峙法具体步骤为：将直径为10mm的香蕉枯萎病致病菌FOC4的菌饼，接种于PDA培养基平板中央，用灭菌的接种环挑取分离的菌落在距菌饼两侧2.5cm处划线，倒置，26℃-28℃下培养，观察菌株抑菌效果。优选的，所述步骤A中，纯化后的内生细菌单菌与灭菌的甘油以1:1混合。其中，甘油的质量浓度为30％-40％。本专利技术还提供该解淀粉芽孢杆菌在香蕉枯萎病菌防治中的应用。本专利技术具有以下有益效果：筛选分离出一株新的解淀粉芽孢杆菌，该菌株对香蕉枯萎病菌具有效果极佳的抑制作用，对于防治香蕉枯萎病具有重要的现实意义。附图说明图1是本专利技术菌株平板照片。图2是本专利技术内生细菌G9R-3不同浓度的脂肽类化合物粗提物对Foc4的抑制作用。图3是菌株平板对Foc4的抑制作用。图4是挥发性气体对Foc4的抑制作用。图5是杀菌剂盆栽杯苗防控效果。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的较优的实施例作进一步的详细说明：具有合成拮抗作用的脂肽类功能基因通过聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)方法检测发现解淀粉芽孢杆菌G9R-3具有合成拮抗作用的脂肽类功能基因，提取解淀粉芽孢杆菌G9R-3DNA，参照文献报道的引物，以该菌株DNA为模板扩增脂肽类功能基因，发现G9R-3含有脂肽类抗生素fenA、ituC、srfA的生物合成相关基因。所用引物参照文献中的方法制备：程凯.防治土传棉花黄萎病微生物有机肥研制与生物效应研究[D].南京:南京农业大学,2010。具有合成β-葡聚糖酶的基因通过聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)方法检测，以解淀粉芽孢杆菌G9R-3DNA为模板，参照文献报道的引物，扩增获得合成β-葡聚糖酶的基因，该基因全长为685bp。实施例1一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌的分离筛选方法，所述筛选具体包括以下步骤：A：取香蕉表面消毒后的根部组织在研钵中，加入适量无菌水进行研磨，取滤液，稀释至10-1000倍后，取稀释液100μL涂布于NA培养基平板上，28℃培养72h后，吸取最后一次清洗样品的无菌水0.2mL涂布平板检测消毒是否彻底。挑取所有单菌落分别转接划线在新的NA培养基平板上，分离纯化。将纯化后的内生细菌单菌落接种于含20mLNA培养液的三角瓶中，120rpm，摇菌24h，与灭菌的40％甘油以1:1混合，-80℃保存备用。B：用平板对峙法从步骤A挑取的菌落中筛选出对香蕉枯萎病菌有抑菌作用的菌株,如图1所示，为菌株平板照片。在本专利技术中，进一步说明，在步骤A中，消毒的具体操作是用质量浓度为75％的酒精漂洗2min，无菌水清洗1次，放入3.25％活性次氯酸钠中浸泡15mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ) G9R‑3，CCTCC NO：M 2017747；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年11月30日。

【技术特征摘要】
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)G9R-3，CCTCCNO：M2017747；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年11月30日。2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌G9R-3CCTCCNo：M2017747的16SrDNA全序列全长为1427bp，如SEQIDNO1所示。3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其扩增获得合成β-葡聚糖酶的基因，该基因全长为685bp，其序列如SEQIDNO2所示。4.一种香蕉内生解淀粉芽孢杆菌的分离筛选方法，其特征在于，包括以下几个步骤：A：取香蕉表面消毒后的根部组织在研钵中，加入无菌水进行研磨，取滤液，稀释后，取稀释液涂布于NA培养基平板上，培养后，吸取最后一次清洗样品的无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：周维，田丹丹，覃柳燕，黄素梅，何章飞，李朝生，韦莉萍，韦绍龙，韦弟，张进忠，龙盛风，孙嘉曼，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西,45