一种地衣芽孢杆菌及其在非水相中制备木犀草素C环琥珀酰糖苷衍生物的方法技术

本发明专利技术涉及一种地衣芽孢杆菌及其在非水相中制备木犀草素C环琥珀酰糖苷衍生物(木犀草素‑3’‑O‑琥珀酰葡糖苷与木犀草素‑4’‑O‑琥珀酰葡糖苷)的方法，属于生物催化技术领域。该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)，命名为地衣芽孢杆菌WNJ02，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018394。本发明专利技术还提供了该菌株在非水相中制备木犀草素C环琥珀酰糖苷衍生物的方法。本发明专利技术中的菌株能够高效催化木犀草素制备木犀草素‑3’‑O‑琥珀酰葡糖苷与木犀草素‑4’‑O‑琥珀酰葡糖苷，解决了木犀草素糖苷类化合物稀缺的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种地衣芽孢杆菌及其在非水相中制备木犀草素C环琥珀酰糖苷衍生物的方法
本专利技术属于生物催化
，涉及一种制备高水溶性木犀草素C环琥珀糖苷衍生物(包括木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷)的菌株及方法，特别涉及一种地衣芽孢杆菌及在非水相中制备木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷的方法。
技术介绍
黄酮类化合物(flavonoidscompounds)是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。近年来，黄酮类化合物的研究进入了一个新的层次，随着对其构效关系的深入研究，发现了部分药理作用的作用机制，为其在医药、食品领域的应用提供了理论依据，加快了黄酮类化合物的开发利用。国外研究者在研究纳豆(大豆发酵食品)等功能食品时，发现了两种新型的黄酮7位琥珀糖苷衍生物(大豆苷元-7-O-琥珀酰糖苷，染料木素-7-O-琥珀酰糖苷)，这两种7位取代的异黄酮琥珀酰糖苷衍生物具有水溶性高(相比于苷元底物，水溶性提高100倍左右)、药理活性强的特点[FoodScienceandBiotechnology,2008,17(1):172-175；BiologicalandPharmaceuticalBulletin,1999,22(11):1193-1201]。后来研究者们又开发了微生物转化的方法，例如本研究团队之前开发的地衣芽孢杆菌ZSP01转化[Biotechnologyandappliedbiochemistry,2015,62(2):255-259]，及解淀粉芽孢杆菌FJ18转化[naturalproductresearch,DOI:10.1080/14786419.2018.1431633]，来实现黄酮类化合物7-O琥珀糖苷取代。然而，众多研究表明，黄酮A环C-7位氧糖苷键的形成对黄酮类化合物的抗氧化活性不利。因此开发新的黄酮其他位置取代(保留7位OH)的琥珀糖苷取代具有重要意义。目前，国际上尚未有关于黄酮类化合物C环3’位及4’位琥珀糖苷取代的报道，且本团队早期开发的两株地衣芽孢杆菌ZSP01及解淀粉芽孢杆菌FJ18，均不能实现此类型转化。菌种诱变(包括化学诱变、紫外诱变、等离子诱变等)及适应性驯化(逆境胁迫，包括低温冷冻驯化、渗透压驯化、高糖、高盐驯化等)手段是科学家提高菌种催化性能，开发新型转化菌种的常用手段。采用低温冷冻驯化技术对菌种进行改良，有望开发具有新的转化功能的菌种。本专利技术的目的是提供一种地衣芽孢杆菌WNJ02及其高效制备木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷(3’-SGL)与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷(4’-SGL)的方法，应用上述菌株在非水相中通过糖基化及琥珀酰化制备3’-SGL与4’-SGL的方法，通过非水相中的琥珀糖基化反应提高木犀草素的水溶性，同时制备得到3’-SGL与4’-SGL。3’-SGL与4’-SGL作为新化合物，此前未有报道。为解决本专利技术的技术问题，本专利技术的技术方案是：一种地衣芽孢杆菌，保藏名称：地衣芽孢杆菌WNJ02(BacilluslincheniformisWNJ02)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2018年6月22日；保藏号为：CCTCCNO：M2018394本专利技术的另一技术方案是：一种地衣芽孢杆菌的用途，在非水相中制备木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷的应用。本专利技术的另一技术方案是：一种使用地衣芽孢杆菌在非水相中制备木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷的方法，该方法以木犀草素和糖基供体为原料，在地衣芽孢杆菌WNJ02的催化作用下，木犀草素3’位或4’酚羟基发生琥珀糖苷糖基化反应，形成木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷。优选的，包括以下三个步骤：步骤(1)：将所述的地衣芽孢杆菌WNJ02，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；步骤(2)：以木犀草素和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；步骤(3)：将步骤(1)的湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。优选的，步骤(2)中所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～150mmol/L，pH为8.0。优选的，步骤(2)中所述的原料溶液，其组分中，木犀草素的浓度为0.01～2.0g/L，糖基供体的溶液浓度为5～50g/L，非水相溶剂体积百分比为5％～20％。优选的，所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。优选的，所述的非水相溶剂为二甲基亚砜或乙醇。优选的，所述的糖基供体选自麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、糊精中的任意一种。优选的，所述的糖基供体为蔗糖或葡萄糖。有益效果：1.本专利技术提供了一种地衣芽孢杆菌WNJ02，难溶于水的底物木犀草素在非水相中可以以相对较高的浓度下与糖供体之间在生物催化剂存在下发生糖基化反应，提高反应的催化效率，解决木犀草素类化合物稀缺的问题，改善溶解度，为进一步研究黄酮类化合物的生物活性奠定基础；与化学法合成相比，具有极高的催化位置与立体选择性，成本较低，分离简单，具备一定的工业化前景；2.相比传统地衣芽孢杆菌，在该菌株的非水相催化体系中，可以进一步得到黄酮C环3’位及4’位取代的琥珀酰糖苷化产物(区别于已报道的黄酮7位取代)，即本专利技术首次利用地衣芽孢杆菌杆菌催化得到木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷；3.本专利技术不仅解决了木犀草素的水溶性低、使用受限的问题，而且所得催化产物木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷均为新化合物，作为新型的木犀草素衍生物，在治疗中风疾病上具有很高的潜在研究价值。附图说明图1是木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷(3’-SGL)的1HNMR谱图。图2是木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷(3’-SGL)的13CNMR谱图。图3是木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷(3’-SGL)的HMBC谱图。图4是木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷(4’-SGL)的1HNMR谱图。图5是木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷(4’-SGL)的13CNMR谱图。图6是木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷(4’-SGL)的HMBC谱图。图7是木犀草素C环琥珀酰葡糖苷(3’-SGL与4’-SGL)对缺血大鼠神经评分的影响。图8是木犀草素C环琥珀酰葡糖苷(3’-SGL与4’-SGL)对缺血大鼠梗死体积的影响(每一列为一只大鼠的6个不同剖面)。本专利技术提供的地衣芽孢杆菌WNJ02已经于2018年6月22日提交中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCCNO：M2018394。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，保藏名称：地衣芽孢杆菌WNJ02(Bacillus lincheniformis WNJ02)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2018年6月22日；保藏号为：CCTCC NO：M 2018394。

【技术特征摘要】
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，保藏名称：地衣芽孢杆菌WNJ02(BacilluslincheniformisWNJ02)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2018年6月22日；保藏号为：CCTCCNO：M2018394。2.一种如权利要求l所述的地衣芽孢杆菌的用途，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌WNJ02在非水相中制备木犀草素C环琥珀糖苷衍生物，包括木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷的应用。3.一种使用权利要求l所述的地衣芽孢杆菌在非水相中酰化制备木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷的方法，其特征在于：该方法以木犀草素和糖基供体为原料，在地衣芽孢杆菌WNJ02的催化作用下，木犀草素3’位或4’酚羟基发生琥珀糖基化反应，形成木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷。4.根据权利要求3所述的地衣芽孢杆菌在非水相中制备木犀草素-3’-O-琥珀酰葡糖苷与木犀草素-4’-O-琥珀酰葡糖苷的方法，其特征在于，包括以下三个步骤：步骤(1)：将所述的地衣芽孢杆菌WNJ02，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；步骤(2)：以木犀草素和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；步骤(3)：将步骤(1)的湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。5.根据权利要求4所述的地衣芽孢杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张森，段金廒，赵明，黄志恒，钱大玮，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32